бактериофаги
Използване на плазмидни вектори могат да бъдат клонирани ДНК фрагменти с дължина до 10 м. Н. Н. Въпреки това, при създаването на геномни библиотеки често се работи с по-големи фрагменти. За тази цел, вектори базирани на бактериофаг л E.coli, са разработени.
След проникване в клетката събитията може да се развие в два варианта. Когато се прилага литична цикъл на фага, който започва бързо да се размножават и след около 20 минути, клетката свива (лизиращ) да се освободи до 100 нови фагови частици. В едно алтернативно изпълнение на фагова ДНК в хромозомата на събития включват E.coli, като профаги в клетката и репликира заедно с обичайните бактериални гени (lysogeny състояние).
Въпреки това, с липсата на хранителни вещества или други неблагоприятни обстоятелства интегрирана фагова ДНК се освобождава и задейства литичната цикъл на развитие. Размерът на фагова ДНК е около 50T. п. п. където съществена част от нея (около 20 м. и. п.) е незначителен за размножаване на фага и е отговорен за включването му в ДНК на гостоприемника. В тази връзка, идеята, че той може да бъде заменен с друг ДНК фрагмент на еквивалентен размер. Получената рекомбинантна молекула ще се реплицира в клетката като ДНК "рекомбинантен" фаг "повишила" в литичната път на развитие.
За да разберете как, е необходимо системата за вектор на базата на фаг, да се разгледа на молекулярните аспекти на цикъла, разтворим. Инфекциозни фаги частиците има глава, в която е затворена плътно опаковани ДНК от приблизително 50 м. Н. Н. и метод на разстояние от него чрез тънки протеинови влакна (фибрилите). Събирателната на процеса на главата и опаковането на ДНК ясно координирани. Фаг ДНК - е линейна две верига молекула дължина 50 m на п ... едноверижна 5 '- "опашка" от 12 нуклеотида. Те се наричат черупките (COS) завършва, защото те са взаимно допълващи се и може да се чифтосват с друг. След фагова ДНК преминава през процес и в Е. коли, COS-краища са свързани да образуват кръгова молекула. Тя представлява линейна молекула, състояща се от няколко сегмента с дължина 50 m. Стр. N на ранен етап в резултат на репликация на ДНК молекули пръстеновиден литична цикъл.
Всеки един от тези сегменти се опакова в протеин главата на последния се присъединява към вече монтирана процес и нови фагови частици. При опаковане на ДНК молекулата от по-малко от 38 m. Н. Н. Тя получава неинфекциозен фаги частиците и фрагменти на повече от 52 m. П. П. Те не се вписват в главата. Сегменти с дължина 50 m. N. N. линейна ДНК молекула отделя COS-сайтове, и се нарязва на тези сайтове на молекулата, когато следващия сегмент изпълва главата. Рязане изпълнява ензим намира на входа на главата.
В резултат на проучвания за изследване на сглобяването на система фагова ДНК опаковка е разработен ин витро за образуване инфекциозни фагови частици. Смесване ин витро обелени празно глава, ДНК на фага се събира и процеси могат да получат инфекциозни фагови частици.
Задачата се състои vtom изследователите да замени централната част на нуклеотидната последователност от приблизително 20 м. Н. Н. желаната ДНК. ДНК, предназначени за клониране, и смила в фрагменти, вариращи по размер от 15 do21 т. Н. Н. Двете лекарства - фагови и хетероложна ДНК - ДНК комбинират и - лигаза. ДНК фрагменти от 50 m. Н. Н. опаковани в главата, които са свързани чрез процеси и образуват инфекциозни фагови частици. Фрагменти от големи (> 52 m. Н. Н.) или по-малко (<38 т. п. н.) размера упаковываться не могут.
Хибридни плазмиди и фаги. В действителност, това е просто един плазмид, който има места за свързване с протеини фаги (наречени COS-сайтове, и той получава своето име, защото тя Космидите). Белтъчна обвивка прави козмид стабилна, което прави възможно да се зареди вече вложка.
Вектори, наречени козмид могат да включват до 40 м. Н. Н. чуждата ДНК и където активният amilifipitsirovatsya в E.coli като плазмид. Космидите комбинират свойствата на плазмидни вектори и вектори на базата на фаг. Например, широко използван козмид pLFR-5 (около 6 м. Н. Н.) има две COS-сайт фаг отделя рестрикционен сайт, полилинкер с шест уникални рестрикционни сайтове, начало на репликация на ДНК (Ори) и ген на резистентност към тетрациклин ( Tc). Това може да се интегрира козмид чуждата ДНК с дължина 40 m. Н. Н. ДНК препарати се смесват и се лигира. Тези легиращи продукти, които съдържат дължина вмъкване на 40 m. Н. Н. има обща площ от близо 50 m. п. п. и следователно могат да бъдат опаковани в ин витро като фаг. Свържете пак молекула pLFR-5 не съдържащи инсерти опаковани няма. След сглобяването на фаговите частици инфектиране на E.coli.
Уловени в бактериална клетка, линейна молекула с инсерт е затворен в пръстена, благодарение на сдвояването на COS-сайтове. В такава конфигурация, че е стабилен в продължение на дълъг период от време може да се реплицира в клетката и хибриден плазмид, тъй като съдържа всички необходими елементи. В допълнение, резистентност към тетрациклин ген осигурява растеж на колониите носещи този козмид. Космидите имат голямо предимство в сравнение с плазмиди: те могат да бъдат включени по-разширени фрагменти, а това означава, че имате нужда от по-малко клонинги и изискват по-малко време, за да създават свои скрининг геномни библиотеки.
Свързани статии