Клетъчната стена на бактерии е тяхната важна характеристика.
За по-подробно изследване на клетъчните структури на бактерии оцветяват микробиологични препарати. Тя може да бъде боядисан живи бактериални форми, но този цвят не дава пълна картина на структурата на микробните клетки. В тази връзка, получен фиксирани препарати от микроорганизми. Ремонт убива живите клетки и едновременно с това ги определя по повърхността на слайда.
Получаване фиксирани оцветяват намазка препарати включва получаване, сушене, фиксиране и оцветяване.
Получаване на намазка. На обезмаслено алкохол плъзгащ се поставя малка капка чешмяна вода и се прехвърля в малко количество й контур "смачкана капка" на материала, както за лекарството. Получената суспензия беше равномерно намазка линия върху площ от 1 - 2 cm слой тънък, колкото е възможно. Намажете трябва да е толкова тънка, че изсъхне бързо след готвене.
Сушене намазка е най-добре при стайна температура на въздуха. Добре подготвени тънка намазка изсъхва много бързо. Ако сушене е бавна, лекарството може да бъде малко по-загрява в поток от топъл въздух над горелка силен огън, поддържане на стъкло на намазка. Тази операция трябва да се извършва внимателно, без да се прегрява натривка или микробните клетки са деформирани.
Определяне на лекарството е няколко цели: да убие микроорганизми, т.е. безопасно нататъшно третиране; осигури по-добра адхезия на клетки на стъклото; направи намазка по-податливи на оцветяване, тъй като мъртвите клетки се оцветяват по-добре, отколкото живеят. Най-често срещаният метод е определянето на топлинната обработка.
За това лекарство обикновено се извършва три пъти през най-горещата част на пламъка, държейки намазка слайд нагоре. Да не се прегрява инсулт, тъй като в този случай настъпват промени груби клетъчни структури, а понякога и на външния вид на клетките, например, им свиване. За да се изследва фината структура на клетките прибягват до определяне на различни химикали. Определяне течност се излива върху намазка или лекарство за определено време потопен в чаша с разтвор на фиксиране.
Оцветяване. Клетките се оцветяват микроорганизми главно анилинови бои. Разграничаване киселинни и основни багрила. За да включват киселинни багрила, чиито анион има свойствата на оцветители имат основна боя хромофор е катион. Примери на киселинни багрила са еозин. еритрозин, Нигрозин, магента киселина; те активно общуват с компоненти на цитоплазмата клетки. Основни багрила - метилен синьо, основния фуксин, тинтява, кристално виолетово, сафра-нин - интензивно се свързват с ядрени компоненти на клетки. Високата концентрация на ДНК и РНК в клетка рибозомни бактерии го прави по-чувствителни към основни багрила. В тази връзка, в микробиологичната практика се използва почти изключително основни багрила.
Разграничаване прости и диференциални микроорганизми оцветяване. В първия случай боя върху цялата клетка, така че да се вижда ясно, неговата форма и размер. Диференциална оцветяване разкрива само някои клетъчни структури и заместващи вещества.
За прост оцветяване на микробни клетки, обикновено са фуксин, тинтява виолетово, метиленово синьо. Фиксираната Препаратът се поставя върху паралелни стъклени пръчки, разположени над тавата, се прилага към разтвора на багрило и се оставя да престои в него за 1 - 3 мин. Погрижете се, че по време на намазка на боя оцветяване да не изсъхва, и ако е необходимо, добавете нова партида от боя.
До края на получаването на цвят се промива с вода, докато течащата вода е безцветен. След това формулировката се суши на въздух или леко се блотират с филтърна хартия, се поставя върху оцветени намазка спад на потапяне масло и разгледана с 100Х леща. За получаване на по-чисти препарати от багрило прилага на намазка, покрити с филтърна хартия. оцветяване метод в синьо на промяната може да се използва вместо багрило разтвор предварително накиснати филтърната хартия с тях. При правилно оцветени и добре измити препарат поле на светъл и чист, боядисани само клетки.
Фиксират и оцветяват също може да продукти-"отпечатъци". Фиксирана, оцветени препарати могат да се съхраняват за дълго време.
Формата на клетките и тяхното подреждане (вериги, контакти, пакети, тетради и т.н.) разкриват, като правило, препарати "смачкана капка", когато светлината поле или фазово-контрастен микроскоп. За да се определи формата на малки пръчковидни бактерии клетки като Serratia marcescens. получаване на препарат на фиксирани клетки и прост оцветяване използвани. Клетките малките бактерии, които имат издатини - prostheca (... Caulobacter родове лабрис Prosthecomicrobium Стела и други), е полезно да се проучи фазов контраст или тъмно поле. Природен подреждане на клетки в колония микроорганизми и спори и спорофори актиномицети и филаментозни гъби изследване на лекарство "отпечатък".
Трябва да се помни, че възрастта на състава на средата и култура условията на културата значително да повлияе на морфологията и цитологията на микроорганизми.
Оцветяване по Грам (сложни оцветяване микроорганизми), и използването му за диференциране на бактерии от различна структура на клетъчната стена.
Този комплекс (като се използва повече от една активна съставка) метод боядисване е предложен за първи път през 1884 г.. Датски учен Н. Gram (Ch.Gram) за боядисване и по-късно става широко разпространено при оцветяване на прокариоти и носи името на своя разработчик.
Значението Грам метод оцветяване в микробиологията се определя, че резултатите от оцветяване бактерии са пряко свързани с техните структурни характеристики на клетъчните стени. Обяснението за това са значителни различия в структурата на клетъчните стени на грам-положителни (съгласно метода на оцветяване в пурпурен) igramotritsatelnyh (съгласно метода на оцветяване в червено) бактерии. Първият от тях са достатъчно дебели слоеве от Мюрейн (у еубактерии) или psevdomureina (у архаебактерии), оформен в задържащото протопласти комплекс "кристал виолет йодо +" и предотвратяване на неговото извличане от клетката в последваща обработка алкохол.
На свой ред gramnegative бактерии такива хетерополизахариди не формират или да съдържат малки количества достатъчни, за да се избегне извличането на комплекс багрило с йод от протопластната време на обработката на алкохол. Казаното по-горе обяснява защо, въпреки привидната простота на метода на Грам, той беше този, който получи най-голямо разпространение като важен таксономичен значение на теста, резултатите от които корелират добре от много други свойства на прокариоти.
За изпълнение на този метод, получаване на специален багрило - карболин разтвор на тинтява виолетово или кристал виолет: 1 г багрилото се стрива в хаван с 2 г кристален карболовата киселина към последователността на каша се добавя на малки порции от 10 мл 96% алкохол, най-накрая се разрежда с 100 мл дестилирана вода се излива в бутилка, е уредено и се филтрира на следващия ден. Вторият основен компонент на оцветяване по Грам е разтвор Lugol. в 10 мл дестилирана вода се разтварят 2 г калиев йодид и 1 г кристален йод, сместа беше добре затворена и се оставя в продължение на един ден, след което 300 мл дестилирана вода.
процедура Грам оцветяване започва с обработката на фиксираните бактериалните клетки оцветяват с кристално виолетово, последвано от третиране на клетките с разтвор на йод. Тези два компонента заедно образуват krupnomolekulyarnyh комплекс е неразтворим във вода и слабо разтворим в алкохол. Следователно, като се използва алкохол, клетките се диференцират: пране в него "Грам-положителни" клетки запазват комплекс "кристал виолет йодо +" и остават синьо, и "Грам-отрицателни" променен цвят. За една и съща, така че да ги вижда, пробите бяха допълнително оцветени с някои контрастен червено багрило - обикновено магента.
Сред многото предложен в настоящото изпълнение, оцветяване по Грам (за GP Kalina от Atkins и др.) Е достатъчно широко modifikatsiyapo AI Blue. за прилагане на предварително приготвен ленти от филтърна хартия, импрегниран с разтвор на кристал виолет и се суши.
Процедура сложни оцветяване микроорганизми:
1) на намазка плъзгача получаване на бактериална култура, която е фиксирана на пламъка на горелката;
2) на тампона се поставя парче филтърна хартия, импрегниран с разтвор на кристал виолет, който се прилага 2-3 капки вода и се оставя да престои в продължение на 2 минути;
3) отстраняване на филтърната хартия;
! 4) без промиване с вода () се прилага лекарството 2-3 капки разтвор на Lugol и се инкубира за 1 минута;
5) кондензиран разтвор на Lugol;
6) се спуска в стъклен плъзгач на микроскоп с 95% алкохол, при което лекарството се промива старателно за 0.5-1 минути, докато не се отклоняват багрило;
7) препарат се промива обилно с вода;
8) се прилага за стъклото на слайд и воден разтвор на фуксин боя над лекарството за 0.5-1 минути;
9) Багрилото се отделя, промива се обилно с препарат вода, суши на въздух и mikroskopiruyut.
Смята се, че в повечето случаи тълкуването на резултатите от цитонамазка Оцветяването по Грам не е трудно, но някои Грам-положителни микроорганизми, по-специално членове на вида Бацилус. може да има грам петно. Напротив, някои щамове на грам-отрицателни родове Acinetobacter и Moraxella не са склонни да оцветят алкохол, така че да изглеждат Грам-положителни.
За да се изясни са предложени такива "грам-съмнителна" специални методи реакцията. В Япония, предложеният метод на "кабел", което позволява да се разграничат с КОН Изпитване на грам-отрицателни микроорганизми. Методът с КОН е способността на клетъчната стена на Грам положителни бактерии да запази своята цялост при излагане на калиев хидроксид, докато клетъчната стена на грам-отрицателни микроорганизми унищожени при посочената експозиция.
Нанася се върху стъклена капка 3% воден разтвор на КОН. Loop да дневно агар култура от бактерии изследвани и старателно емулгирани. При положителен отговор, ако капка суспензия става вискозен, слуз резба контур са изготвени в продължение на 0.5 - 2.0 cm, и още повече, е - Грам - ако не, Грам-положителни бактерии. Сметката на този процес е по-удобно на черен фон.
Образование лигавицата последователност след обработка грама КОН поради излизане на клетъчната ДНК е вискозен компонент.
Свързани статии