Този метод е по-универсална. Количеството на вирус (вирусен титър) по този начин се измерва в 50% ефективна доза - ED50.
1 ED50 = доза от вирус, който може да доведе до инфекциозна ефект в 50% от инокулираните тестови обекти.
За всеки избран вирус податливи на изпитвания обект - лабораторни животни (обикновено бели мишки), ембрионни кокоши яйца или клетъчна култура. Инфекциозен вирус ефект или ефекти върху различни системи за изпитване може да се прояви смърт, клиничните симптоми и промени pathoanatomical цитопатичен ефект. При лабораторни животни и пилешки ембриони ефект на вируса се оценява на смъртоносни и инфекциозни дози:
1 LD50 - дозата на вируса, която убива 50% от лабораторни животни;
Аз ELD50 - дозата на вирус, който убива 50% от кокоши ембриони;
1 ID50 - дозата на вирус, който предизвиква клинични симптоми или патологични промени в 50% от заразените лабораторни животни;
EID50 1 - доза от вируса, който причинява патологични промени в 50% от заразените ембриони мацка.
В клетъчна култура ефект на вируса се оценява чрез цитопатичен ефект или ефект (СРЕ)
TSPD50 1 - доза на вируса, който причинява цитопатичен ефект в 50% от епруветки с заразената клетъчната култура.
Брой ED50 (LD50 ELD50, ID50 и TSPD50 EID50) вирус, съдържаща се в единица обем от вирус-съдържащ материал е израз титър на вируса в този материал. Така, запис Т = 103.48 TSPD50 / 0.1 мл означава, че всеки 0.1 мл вирус-съдържащ материал се съдържа 103.48 дози, всяка от които може да предизвика цитопатичен ефект в 50% от епруветки с културата на клетки.
Virus титруване, 50% инфекциозни действие е подходящ за почти всеки титруване на вируса, ако вдигнете чувствителни към него на живо тестова система. Недостатъкът е, сложността, продължителността и необходимостта от статистическо изчисление.
Метод за определяне на вирусния титър в единици от 50% инфекциозна действие (LD50 ELD50, ID50, EID50 и TSPD50) е да се намери разреждане на изпитваното вирус-съдържащ материал в размер на инфекциозна доза, която ще съдържа един ED50 и след това се изчисли колко такива единици вирусът се съдържа в същия обем на вирус-съдържащ материал. Това ще бъде на вирусния титър на. За да направите това:
1) на пробата от вирус-съдържащ материал се получава серия от последователни 10-кратни разреждания. Броят на разреждания нуждаят от повече усилия (т.е., така че последният вече не е най-високата даде инфекциозен ефект изобщо). За 10 последователни разреждания на всяка от 10 стерилни епруветки се излива в 9 мл стерилен физиологичен разтвор и след това плавно въведени в първите 1 мл от суспензията. Разбърква се съдържанието на първата тръба, 1 мл печалба и да втората тръба, съдържанието се разбърква и 1 мл от втората тръба - в третото и така нататък ,.
2) на същия обем от всяко разреждане на вирус-съдържащ материал зарази податливи на този вирус живи тестови обекти. Във всеки от групата, изисква най-малко 4-6 тестови обекти (за статистическа достоверност);
3) след време се вземат предвид резултатите от действието на вируса на заразени обекти (смърт, болести, патологични изменения, или цитопатичен ефект). Смъртта на лабораторните животни, ЕК първите 48 часа се счита за неспецифични. Счетоводни прекратява след 2 до 3 дни след прекратяване на случай;
4) определя, в които разреждането на вируса се оказа ефективна от 50% от чувствителни обекти. Ефект на вируса се определя LD50 ELD50, ID50 и TSPD50 EID50. Смята се, че тази доза съответства на разреждане 1 ED50. Дозата на вируса се преброяват с помощта на различни методи (Reed и Menchu, Kerber).
За титруване на вируса съдържащ материал изследва се получава серия от последователни десеткратни разреждания 1:10, т.е. 10 -1 до 1: .. 10.000.000, т.е. 10 -7. или повече (10 1. 10 -2. 10 -3. 10 -4. 10, -5, и т.н.). Размерът на разреждане зависи от очакваното на вирусния титър, те трябва да се готви достатъчно до последния (най-високата) разреждане вече няма да дам един заразен ефект. Инфекциозни вирусни ефект (величина инфекциозен ефект) от всяко разреждане се намалява пропорционално на логаритъма на разреждане (или доза). Това означава, че при разреждане 1: 100 (10 -2) заразна ефект наполовина ако 1: 1000 (10 -3) три пъти и др ...
Всяко разреждане на материала за изпитване вирус-съдържаща в специфични идентичен обем, равен групи зарази податливи на този вирус дневен тест обект (лабораторни животни, пилешки ембриони, тъканни култури). Така помисли тропизъм и вирусна доза, обичайни за този начин на прилагане на материала. Всяка група трябва да бъде най-малко 4-6 тестови обекти, т. К. С по-малко статистическа обработка на материала, ще има твърде много грешки.
Въпреки това, при определянето на вирусния титър е много трудно да се намерят такива разреждания, че един от тях ще бъде точно причинили смъртта на 50% от заразените животни. Често по време на броя на титриране на живи и мъртви животни е неравно. В този случай, по-точно да се определи титърът широко използван в метод вирусология, предложен от Рийд и Мюнх. Те се препоръчват за титриране да се вземат в опита на голям брой групи от по 4-6-чувствителни модели във всяка група. Отклонението от истинската стойност на LD50 се дължи на употребата на малки количества опитни животни в групата се коригира с това, че при изчисляване на процент смъртност оперира с данните на кумулативната смъртност (натрупване - натрупване).
Рийд и Мюнх метод, базиран на логическия предпоставката, че животните (и други модели), които са починали след заразяване с разреждане на вируса, например, 10 -5. и умират по време на инфекция нисш разреждане (10 -4. 10 -3) вирус. Ако животното не попада в това разреждане, той остава жив и докато заразяване висока разреждане (10 -6. 10 -7). Въз основа на това, получените резултати са подложени на интерполация и експресират тях под формата на кумулативни данни въз основа на който изчислява% смъртност.
При изчисляване кумулативни мишки с данни паднали от по-високо разреждане, се добавя в броя на смъртните случаи от долната разреждане. Мишките остава жив от по-ниско разреждане, се добавя към броя на животните, които не са умъртвени по-високо разреждане (в посоката, показана със стрелка). След получаване на данните се определи кумулативният% смъртност. смъртността в проценти за всяко разреждане се изчислява, както следва:
% Смъртност = броя на мъртвите (кумулативни данни) / Максимална заразени (кумулативни данни) х 100
Разрежданията на която смъртност% приближаващи 50%, по най-високата и най-ниската критична доза.
LD50 се определя от формулата:
,
където LD50 - желания разреждането на вируса; Б - разреждане причиняване на смърт на повече от 50% от животните; б - процентът на смъртност съгласно размножаване В; и - процентът на смъртност съгласно разреждане, което дава смъртта на най-малко 50% от животните; г - коефициент на разреждане.
Титърът на вируса, изразена от редица с фракционна експонента, обикновено в такава форма, и се оставя. Това може лесно да се превърнат в абсолютна стойност и използване antilogarithms маса (4 числа математически Bradis таблици). Както Таблица antilogarithms определят абсолютната стойност на разреждането, съответстващ на 1 LD50.
Свързани статии