Клониране на ДНК ин виво - тайнствен наука - Издател

Предишен ◈ Следващото

Има два подхода за клониране на ДНК. Първият подход включва използването на бактериални или дрождени клетки се размножават въведени в него чужда ДНК. Вторият метод е ДНК амплификация ин витро.

Клониране на ДНК ин виво

Използването на микроорганизми може да създават два вида ДНК библиотеки: геномни и клонални.

Генната банка. Ако генома на организма да се намали, поставете в плазмид или вирусен вектор и се въвежда в клетката, може да се съхранява в тази форма. При рязане плазмид или фаг ДНК вероятността от цели и непроменени части от генома е доста висока.

Този метод за получаване на геномна библиотека, наречена "пушка секвениране", тъй като в този случай генът съдържа отделни фрагменти.

Принципи за създаване на плазмид и вирусни вектори като цяло, така че можем да ги примера на плазмид разгледа. Трябва да се отбележи, че тъй като на вирусната ДНК е по-добре да се използват фагови ДНК, тъй като те имат по-голям капацитет и ще направи възможно да се вмъкне по-големите парчета на генома.
Пречиства кръгова ДНК молекула се обработва с рестрикционен ензим за получаване на линейна ДНК. Клетъчната ДНК се третира със същия рестрикционен ензим, плазмид се добавя, добавя лигаза. Така получен рекомбинантен плазмид ДНК, която се въвежда в бактериални или дрождени клетки. Плазмид репликира и образуват множество копия. Много плазмиди носят ген за резистентност към антибиотици, и ако рекомбинантния плазмид е ген, клетките бяха лесно идентифицирани чрез отглеждане в среда с антибиотик.
Всяка колония е потомство или клонинг на една клетка. Плазмидите, съдържащи единична колония клон геномна ДНК и плазмиди агрегат може да се нарече геномна ДНК библиотека. Недостатък на този метод е, че ДНК фрагменти се произвеждат в големи количества. Рязане случай на геномна ДНК се определя, така че само част от фрагментите съдържат пълни гени. Някои фрагменти могат да съдържат само част от ген или интронни последователности.

кДНК библиотека. Осъществяване сДНК синтез започва с RNA шаблон чрез обратна транскриптаза комплементарна ДНК верига. След създаване на основни условия унищожи РНК нишка на нуклеотиди, след това се използва ДНК полимераза синтезира комплементарна ДНК верига. Това представлява ДНК фрагмент с тъпи краища. Тази ДНК се вмъква в плазмида и се въвежда в бактериална клетка. Когато амплификацията плазмид генерира допълнително копие от ДНК клон.

Предимства за клониране на ДНК клон геномна ДНК, която кодира протеин, нуклеотидната последователност на гена не прекъсва.
Гените на еукариоти съдържат интрони, които трябва да бъдат отстранени от transkriptnoy РНК преди превръщането му в матрица, последвано от съединяване. Бактериални клетки не могат да извършват такава модификация на РНК, образуван от транскрипцията на гена на еукариотна клетка. Ето защо, ако преследва препарат протеин чрез експресия на клонирания ген, е добре да се използва сДНК библиотека получава въз основа на РНК.

Геномни библиотеки, клониране на ДНК ин виво

След ДНК се омрежен ин витро, е необходимо да се реплицира, т.е. клонинг. Цел: да се получи множество копия на желаните гени. За клониране на малки ДНК фрагменти, или плазмиди, фаги ДНК за голям - козмиди и изкуствени хромозоми.

Има два подхода към клонирането на ДНК:

1) използването на бактериални или дрождени клетки се размножават въведени в него чужда ДНК.

2) амплификация на ДНК ин витро.

Използването на микроорганизми може да създават два вида ДНК библиотеки: геномни и клонални.

Геномна библиотека - колекция от ДНК клонове, включително всички фрагменти, принадлежащи към генома на вида. Д. генетична банка все още може да се нарече набор от клонирани геномни фрагменти. Ако генома на организма да се намали, поставете в плазмид или вирусен вектор и се въвежда в клетката, може да се съхранява в тази форма. При рязане плазмид или фаг ДНК вероятността от цели и непроменени части от генома е доста висока.

Принципи за създаване на плазмид и вирусни вектори като цяло, така че можем да ги примера на плазмид разгледа. От вирусната ДНК е по-добре да се използват фагови ДНК, тъй като те имат по-голям капацитет и ще направи възможно да се вмъкне по-големите парчета на генома.

За създаване на генна банка трябва да:

1) изолиране на цялата геномна ДНК

2) фрагментиране на ДНК с рестрикционни ензими или ултразвук

3) Пречистена кръгова ДНК молекула се третира със същия рестрикционен ензим за получаване на линейна ДНК. Клетъчната ДНК се добавя към плазмида в присъствието на лигази. Така получен рекомбинантен плазмид DNA

4) rekDNK въвежда в бактериални или дрождени клетки, където плазмид се повтарят за да се образува много копия.

5) Клониране на бактерии: Всяка колония стана клетки е клонинг на една клетка или потомство. Плазмидите, съдържащи единична колония клон геномна ДНК и плазмиди, определени форми на геномна ДНК библиотека.

Недостатък. ДНК фрагменти се произвеждат в големи количества. Рязане случай на геномна ДНК се определя, така че само част от фрагментите съдържат пълни гени. Някои фрагменти могат да съдържат само част от ген или интронни последователности.

Предимство: ген библиотека могат да бъдат съхранявани и използвани за неопределено време.

-източник на материал за изследване на структурата, функцията и регулирането на отделни гени, протеин структурата и функцията

-съхраняване на генетичния фонд на застрашени видове

Подобни сбирки, получени от отделните хромозоми или части от тях, наречени хромозомни библиотеки.

Клонирането на ДНК. Етапи на ДНК клониране. Рестрикционни ензими. Ограничаване. Ендонуклеазата.

Клониране на ДНК ин виво включва 6 етапа:
1) получаване на ДНК фрагменти, включително гени, или части от тях с рестрикционен ензим;
2) рекомбинация на фрагментите
3) вкарване на ДНК фрагмент във вектор;
4) трансформация с вектор на организма гостоприемник;
5) Скрининг за рекомбинантния вектор
6) избиране на клонинги на интерес за изследователите.

Някои рестрикционни ензими, както и последователността на нуклеотиди, че те разпознават и рестрикционни сайтове в тези последователности

Рестрикционни ензими. Ограничаване. Ендонуклеазата.

Във всяка човешка хромозома, има само една непрекъсната нишка на ДНК. Той е пълен с усилено, за да се вмести в хромозома. Манипулирани ДНК молекула от тази дължина е практически невъзможно.

Следователно, откриването на 70-те години на XX век. специални бактериални ензими. намаляване на ДНК в фрагменти, че е много удобно. Ензимите са наречени рестриктази или ендонуклеази.

В бактерии, тези ензими се използват за защита срещу проникване на чужда ДНК в клетка. Обикновено рестрикционния ензим признава т.нар палиндромната последователност от нуклеотиди, наблюдавани в двете вериги на ДНК и се състои от 4-6 нуклеотида.

Примери на няколко рестрикционни ендонуклеази са показани в таблица.

Геномни библиотеки, клониране на ДНК ин виво.

След ДНК се омрежен ин витро, трябва да се размножава, т.е. клонинг. Цел: За да получите копие на множество гени искат. За клонирането на малки ДНК фрагменти се използват от плазмид или фаг ДНК за голям - козмиди и изкуствени хромозоми.

Има два подхода към клонирането на ДНК:

1) Въвеждане на бактериални или дрождени клетки за размножаване на въведения чуждата ДНК инча

2) амплификация на ДНК ин витро.

Използването на микроорганизми, е възможно да се създадат два вида ДНК библиотеки: геномни и клонални.

Генни библиотека - колекция от ДНК клонинги, включително всички парчета, включени в генома на вида. Д. генетична банка все още може да се нарече набор от клонирани геномни фрагменти. Ако генома на всеки организъм, за рязане, тяга в плазмид или вирусен вектор, и да се въведе в клетката, в тази форма, то може да бъде записан. При рязане плазмид или фаг ДНК възможността за загуба на целия геном и немодифицирани фрагменти е доста висока.

Такъв метод за получаване на геномна библиотека е наречен "пушка секвениране" тъй като генът в този случай е представена от отделни парчета.

Принципите на създаване на плазмид и вирусни вектори общи защото те правят върху примера на плазмида. От вирусната ДНК е по-добре да се използва фаг ДНК, защото те имат голям капацитет и ще ви позволи да поставите по-големите парчета на генома.

За създаване на генна банка е необходимо:

1) изолиране на цялата геномна ДНК

2) фрагментиране на ДНК с рестрикционни ензими или ултразвук

3) Пречистена кръгова ДНК молекула се третира със същия рестрикционен ензим за получаване на линейна ДНК. Клетъчната ДНК се добавя към плазмида в присъствието на лигази. Така Makarom получен рекомбинантен плазмид DNA

4) rekDNK въвежда в бактериални или дрождени клетки, където плазмид се повтарят за да се образува много копия.

5) Клониране на микробите: всяко колонии, които се появяват клетки е клонинг на една клетка потомство. Плазмидите, съдържащи единична колония клон геномна ДНК и плазмиди съвкупност форми геномна ДНК библиотека.

Липса: ДНК парчета, произведени в неограничени количества. Намаляване на геномната ДНК се определя от случая, тъй като само малка част от тези фрагменти съдържат гените. Някои части могат да съдържат само част от гена или интронни последователности.

Предимство: ген библиотека може да се съхранява за неопределено време и се използва за дълъг период от време.

-съхраняване на генетичния фонд на застрашени видове

Такова събиране придобито от личните хромозомите или части от тях, са посочени като хромозомни библиотеки.

Може би ще се интересуват от работата, свързана с: геномни библиотеки, клониране на ДНК ин виво.

Open Source за управление на съдържанието

Писане и да вземе решение за всяка тема по микробиология и въпроси! Изпълнение в най-кратки срокове за хубава цена! Попълнете формата по-долу и ще получите отговор в рамките на 15 минути.

Клонирането на ген е процедура, включително избора и амплификация на специфични гени в реципиентни клетки, про или еукариотни. От РНК освобождава от същия тип клетки в тялото, отстраняване на ДНК копие. които след това се въвежда в клетките реципиенти и усилва. Клониране на ДНК ин виво включва 4 етапа:

4) трансформация с вектор на организма гостоприемник;

5) Скрининг за рекомбинантния вектор

6) избиране на клонинги на интерес за изследователите.

Реципиентни клетки - клетки, избрани за генна клониране могат да бъдат про- така и еукариотни.

иРНК се изолира от клетки или тъкани, в които се експресира гена.

Синтез на ДНК - ензим извършва копия на РНК-зависима ДНК полимераза. към настоящия

ензим присъедини изисква кратко едноверижна ДНК праймер; за тази цел, като правило, използвайте олиго. Семената спонтанно образува двуверижна ДНК комплекс със сегмент на поли.

Деполимеризирането оригиналната РНК верига се осъществява чрез алкална хидролиза. ДНК верига

устойчиви на третиране с основа, и РНК е напълно деполимеризирана. Получената ДНК е едноверижна.

Двойно верижна сДНК се получава чрез попълване VH сДНК на двуверижна форма, изпълнена от полимераза I. ензима ДНК Тази сДНК може да бъде вмъкнат във вектора.

Има два основни типа на вектори, бактериални плазмиди и бактериофаги.

Плазмид - се екстрахромозомен клетки се срещат в елементите, съставляващи затворен пръстен молекулата двДНК. За да се даде възможност на кДНК в плазмид, плазмидът затворен пръстен трябва да бъде "отворен". Към този плазмид се подлага на рестрикционен ензим.

Рестрикционен ензим - порязвания двДНК в специфични нуклеотидни последователности, известни като рестрикционни сайтове.

Омрежване - процедура, в която чуждата ДНК е интегрирана между - тази процедура, необходимостта от което се дължи на факта, че при получаването на първоначалната сДНК има много различни иРНК и само част от плазмид носи желаната ни ген.

Усилване се осъществява от факта, че в една бактериална клетка може да синтезира множество копия на плазмид представлява интерес за нас, както и чрез получаване на голям брой клетки с тези плазмиди. След изолиране и пречистване на плазмид се третира с подходящия рестрикционен ензим, който реже ги вградена в копие на желания ген. Амплифицираният гена по този начин може да се използва за по-нататъшни експерименти в генното инженерство.

Източници: www.biotechnolog.ru, studopedia.ru, dommedika.com, reftrend.ru, biologymic.ru