Наука на методите за фотометрия на оптични лъчения потоци в зависимост от дължината на вълната се нарича спектрофотометрия. Тя включва фотометрия, спектрометрия и метрологията.

Фотометричните измервания като пропускливост или коефициент на огледално отражение са относително прости и се основават на факта, че падащата светлина лъч инжектираната проба и да поток преминава през (или отразена от него, съответно) към потока на инцидент в отсъствието на пробата.

В дифузно отражение или предаването е необходимо да се съберат всички лъчи, разпръснати в различни посоки. В този случай, за измерване на отражение и предаване коефициенти често се използват фотометрично интегриране сфера, с дифузно отразяваща бяла вътрешна повърхност.

Такива балони се използват за измерване на светлинния поток от източника на светлина (радиационен източник се поставя в играта). Експеримент Идеята е, че осветеността от множество отражения във вътрешността на топката равномерно разпределено в рамките на своите вътрешни повърхности и право пропорционално на общия светлинен поток. Ако някоя точка от вътрешната повърхност на топката, за да се защитят срещу преките лъчи от източник, неговата осветление ще бъде пряко пропорционално на общия светлинен поток. Провеждане на измерването последователно с позоваване и на тест-проба, получена относителна осветеност може да бъде изчислена светлинен поток от източник проба.

Спектрометрия включва разнообразие от спектроскопски инструменти, които са част от спектрофотометър.

Като цяло, в спектрофотометър включва: източник на оптични лъчения, апаратът за осигуряване на необходимите спектрални интервали (монохроматор или набор от филтри), фотодетектор, и система за откриване на сигнал. Системата за запис може да бъде единичен канал (обикновено изградена на базата на монохроматор, в която сканиране се извършва чрез завъртане на дифракционната решетка или призма) или многоканален (не се прилага сканиране и дискретен брой на дължини на вълните в polychromator или части от непрекъснат спектър в спектрографи се записват едновременно). Всяка от модерен серия спектрофотометри монохроматор е поставен между източника на светлина и на пробата, за да се минимизира ефектът на фотохимично сондиране радиация.

При измерване на кривите на абсорбционни спектри обикновено се получават в която в абсциса броя на вълната или вълна и ордината ос - прозрачността или оптична плътност.

Един важен фактор за премахване на грешки в спектрофотометрични измервания е изборът на диапазон от стойности на измервания сигнал. Що се отнася до определяне на прозрачността, на два сигнала се сравняват абсорбция или трансмисията, важно е, че разликата им е много по-голям от нивото на шума.

За да се определи правилно стойностите на D и Т е много важно да се отчете влиянието на отразените и разпръснати от елементите на пробите и светлина оборудване. Освен приемника на измерената дължина на вълната на излъчване е винаги по един или друг начин, се отразява или разсеяна радиация на оптични компоненти на устройството на друга дължина на вълната (обикновено не повече от източника на светлина). Минималното ниво на разсеяна светлина са спектрофотометри оборудвани с двойно монохроматор, особено с комбиниран призма-решетка диспергиращо устройство (тип Shimadzu мод. UV-365). Въпреки това, той не трябва да се поласкан паспортните устройства с висок капацитет (най-новите стойности характеризират с оптични плътности до D = 5). Ако не бъдат взети мерки, за да не всички се сведе до минимум въздействието на страничен (разпръснати) светлина приет от монохроматор при тези дължини на вълната, когато обектът на изследване не абсорбират, измерените стойности на оптичната плътност и прозрачност може да бъде далеч от истината.

Делът на разсеяна светлина (I) е особено висока с това, че спектрална област на измерване където ниска чувствителност на фотодетектора или яркостта на източник и е най-силно изразено при интензивно регистрация абосорбция. Измерената оптичната плътност D B regB е по-малко от истинската D:

Разсейване на светлината в по-голямата и по повърхността на пробите и тяхната фотолуминисценция, да се въведе допълнително изкривяване в спектрите наблюдавания абсорбция. Светлината модел разсейване води до нарушаване на спектъра и за неправилно определяне на стойностите на оптичната плътност.

Измерване на луминисценция спектри

За разлика от флуоресцентна спектроскопия чрез други техники спектроскопски се състои в това, че записва спектралната зависимост е функция на две променливи - дължина на вълната на възбуждане л B ExB и дължина на вълната на емисиите л B EMB. Ако л B ExB поддържа постоянна и л B EMB сканирани, измерената флуоресценция спектър I (л B EMB) (спектралната зависимост от интензитета на флуоресцентно излъчване на дължината на вълната). Ако сканирате л Б ВБМ при постоянно EMB л B. получената флуоресценция възбуждане спектър I (л B ExB) (спектралната зависимост на ефективността на флуоресценция възбуждане на дължина на вълната). В графична илюстрация на емисиите спектри на (или възбуждане) флуоресценция на хоризонталната ос представлява дължината на вълната (в нанометри) или брой вълни (в см P -1 P), а оста на ординатата - флуоресцентен интензитет I B FLB (в произволни единици). Ако оптичната абсорбция на светлината е достатъчно малък и спектралното разпределение на широка светлината се счита за правилно, спектърът на възбуждане е подобен по форма на спектъра на абсорбция.

В течни разтвори на отделните органични молекули обикновено образуват Емисионният спектър на флуоресценция е независим от дължината на вълната на възбуждане. Форма лента вярно молекулно разтвор на спектъра флуоресценция, в повечето случаи огледално симетрични с най-дълга дължина на вълната на абосорбция. Обикновено тези ленти perekryvyutsya един с друг в определен спектрален диапазон.

При възбуждане с ръба много дълга дължина на вълната на спектъра на абсорбция, флуоресцентни спектри на твърди молекулни разтвори се изпитват изместване.

За да се изследва спектралното разпределение на излъчваната светлина от пробата са флуоресцентни спектрометри. Тези устройства могат също така да измерват промяна в интензитета на емисиите в сравнение с дължина на вълната на възбуждане (флуоресценция възбуждане спектрите).

Спектрофлуориметър се състои от следните устройства: източник на светлина на възбуждане; Устройство за изолиране спектрални интервали луминисценция възбуждане и регистрация (в най-разнообразни устройства е monochromators); фотодетектор с електронна система за запис на сигнали.

Предаването на чувствителността на монохроматор и фотодетектор зависи от дължината на вълната. Следователно, за да се получи вярно разпределението на относителни интензитети в спектрите на флуоресценция се измерва ток в зависимост от дължината на вълната на фотодетектора трябва да се регулира на функцията за калибриране (спектрална чувствителност на устройството). В противен случай, измерена спектралното разпределение не отразява вярно спектър на флуоресценция. Повечето съвременни спектрометри корекция спектри автоматично. Спектрите получен по различни инструменти, в никакъв случай не може да се сравни, ако не е сигурно, че те са адаптирани към спектралната чувствителност на устройството.

Спектрофлуорометрия особеност е, че емисията на флуоресценцията възниква във вътрешния обем на пробата е изотропна и се разпространява във всички посоки (в пълен пространствен ъгъл на 4 п). Условия за събиране на тази радиация на фотодетектор и геометрична форма модели силно влияят върху интензитета на детектираната флуоресценция спектри. Нарушение изотропия условия в оптичния път или пробата може да доведе до промяна в спектралната форма.

Флуоресценцията е изключително чувствителен метод. Следователно, силно изкривяване на спектъра може да бъде причинена от разсейване на светлината в пробата и (или) наличието в него на дори малки количества примеси. Примесите могат да доведат както до нарушаване на реалния принос на спектрални зависимости на тяхното излъчване, и интензивността на луминесценция, за да намалите до пълното закаляването. Всяко компенсация на тези ефекти или профила си чрез измерване референтни проби, които не съдържат луминисцентни изследва възможни връзки.

Дори в пълната липса на смущаващи фактори, експериментално измерена спектралната зависимост не винаги съответстват на истинската спектър на флуоресценция. интензивността им може да зависи от геометричната засичане на флуоресценция схема спрямо посоката на широка светлинния лъч.

Ако тестовата проба оптичната плътност е ниска (D <0,1), то интенсивность флуоресценции одинакова в любой точке вдоль пути возбуждающего света через образец. При увеличении оптической поглощательной способности образца интенсивность флуоресценции, регистрируемой под прямым углом, вначале растет, затем ее рост постепенно замедляется и, наконец, падает, поскольку флуоресценция почти перестаёт проходить сквозь основной объем образца. При этом флуоресцирует лишь часть образца, прилегающая к поверхности на которую падает возбуждающее излучение. Регистрация флуоресценции с этой поверхности (регистрация "на отражение") позволяет проводить измерения и в таких условиях. При регистрации "на отражение" наблюдается насыщение роста интенсивности флуоресценции с ростом концентрации флуоресцирующих молекул.

Такова поведение флуоресценция, заедно с геометрията на експеримента, поради два ефекта: абсорбция на светлината на възбуждане и с оглед на присъщата флуоресценция на обема на пробата. Първият ефект се нарича вътрешен филтърен ефект, а вторият - или реабсорбция вторичен абсорбцията. Нека да ги обсъдим по-подробно.

вътрешен филтърен ефект се наблюдава при високи оптични плътности и се състои в това, че интензитетът на светлината вълнуваща в обема на устройството за дистанционно управление на проба от източника на светлина е по-малко от най-близо до обем източник. Предни слоеве примерни работи като филтър, която поглъща голяма част от вълнуващия светлина. Осветяването на пробата става неравномерно и интензитета на луминисценция намалява. При много високи концентрации на светлината на възбуждане се абсорбира почти напълно, и флуоресценцията се наблюдава само от тънък повърхностен слой. Формата на спектъра флуоресценция не може да бъде нарушена и, ако е достатъчно малка абсорбция в областта на припокриване на спектрите на поглъщане и флуоресценцията или се застъпват леко. вътрешен филтърен ефект може да бъде причинена от леки абсорбиращ компоненти на пробата, включително разтворителя (полимерна матрица) и примеси. Нарушаване на флуоресценция спектри поради вътрешната филтъра ще възникне, ако абсорбция на тези компоненти е в спектралната област на изследване флуоресценция.

Ако абсорбцията и флуоресцентни спектри припокриването и оптичната плътност на пробата в областта на припокриване е голям, наблюдаваната абсорбцията на присъщата флуоресценция на светлина от флуоресцентен компонент - реабсорбция или вторичен абсорбцията. Ефектът на реабсорбция, заедно с намаляване на интензитета на флуоресценцията, винаги води до нарушаване на формата на спектрите. В този счупен огледалната симетрия на спектрите на поглъщане и флуоресценция. Това е така, защото реабсорбция причинява изкривяване на спектъра флуоресценция изключително в областта на неговия припокриване с спектър на абсорбция. В резултат на тези нарушения постепенно с увеличаването на оптичната плътност на пробата в областта (например, чрез повишаване на концентрацията на флуоресцентен компонент) изчезва къси вълни (за много фосфор като право вибрационна структура) част на спектъра флуоресценция. Изкривяването става по-голяма, толкова по оптичната плътност на флуоресцентен компонент в припокриване спектри. В крайна сметка, истинската флуоресцентен спектър е дълга дължина на вълната опашка безструктурен разположена по същество извън региона на присъщата абсорбцията на флуоресцентен компонент. Спектрален максимум образуване безструктурен може да бъде десетки нанометра до предубедени по отношение на позицията на максимума на истински спектър.

Феноменът на реабсорбция дължи както свойствата на флуоресцентно вещество и измерване на флуоресценция методически функции. Както бе споменато по-горе, добивът на луминисценция квантовата е винаги по-малко от единица и част от светлината се абсорбира от молекулата се консумира nonradiatively. Това означава, че с всеки акт на вторичното абсорбция на интензитета на флуоресценция на фотонна емисия на флуоресценция се намалява още повече. От друга страна, в изотропна среда молекули излъчват флуоресценция в пълен пространствен ъгъл на 4 п. Докато флуорометри техническите възможности позволяват да събере светлина върху фотодетектор в пространствен ъгъл с разтвор на 30 P 0 P P -40 P. за това е само около 10% от общото количество на емисиите. Имайки предвид, ъгълът на светлина събиране и факта, че всеки вторичен е погълнала фотон на луминесценция молекула той излъчва в обхват до интегриран интензивност определя от квантов добив, е лесно да се види, че повече от десет пъти намалена с вторичен излъчване на всяко събитие записва флуоресцентния интензитет.

Очевидни промени във формата на спектрите и спектралните промени поради тривиално ефект реабсорбция неопитен изследовател може да се тълкуват поради структурни промени в пробата. Например, експресия на резорбция може да се тълкува като натрупването на чувствителни флуоресценция в резултат на трансфер на енергия от донора на акцептор или погрешно дължи на образуването на excimers. Следователно, трябва винаги да се помни, че интензивността на изкривяване и форма на флуоресценция спектрите на лентите е незначително само когато оптичната плътност на пробата в припокриващата област на спектъра на абсорбция на флуоресцентен компонент с спектъра на излъчване си (възможно е да наричаме този брой "оптична дебелина" на пробата) не надвишава по време на измерванията флуоресценция 0,01-0,05 стойности. Когато такива оптични плътности едва проявяват и вътрешен филтърен ефект. Изисквания към този фактор на примесите, не е толкова трудно, ако искате да се измери само с формата на спектъра от флуоресценция, а не тяхната интензивност и усвояването на примеси пропуска флуоресценция групата. При измерване на доходността луминесценция квантовата на счетоводни нужди примес фактор.

Както можете да видите, на правилното измерване на спектрите на луминесценция е възможно само при ниски оптични плътности. Избор на желаната стойност на оптичната плътност е възможно чрез намаляване на концентрацията на луминисцентни компоненти в изображението или чрез намаляване на дебелината на слоя. Въпреки това, в последния случай това не винаги е възможно да се елиминира проява на реабсорбция. В тънки слоеве на разтвор (1 мм) с оптична плътност от около 0,04 ясно наблюдаван реабсорбция ефект. Елиминиране на пълно вътрешно отражение ефект се намалява само наполовина. Най-добър ефект се получава чрез ограничаване на напречните размери на вълнуващо лъч. В този случай, ние наблюдавахме спад десетократно в принос реабсорбция почти пропорционално намаляване на площта на възбуждане. Този феномен може да се обясни с реабсорбция размножителен обем флуоресценция по абсорбиращ слой (в посока, перпендикулярна на широка греда). С намаляване на дебелината на ролята на реабсорбция поради пълно вътрешно отражение.

1. Какво се нарича спектрофотометрия?

2. Извършва се пропускливост и отражението?

3. Опишете работата по интегрирането на фотометрични топки.

4. Какви са съставките на спектрофотометър?

5. Какво трябва да се вземат предвид при определяне на правилната оптична плътност и прозрачност на средата?

6. Каква е разликата между флуоресцентна спектроскопия от другите спектрални техники?

7. Кои са основните елементи се спектрофлуориметър?

8. Какъв е ефектът на вътрешен филтър?