Въвеждане на ген в клетка

Видовете вектори за въвеждане на ген в клетка

Съществуват няколко вида на вектори:

По-голямата част на клетъчната ДНК на бактерии, съдържащи се в хромозома (хромозома в E.coli, например 4 Mill. Базови двойки). Въпреки това, с изключение на бактериална хромозома съдържа голям брой много малки кръгови молекули ДНК плазмиди дължина от няколко хиляди базови двойки (молекулно тегло 1.5 до 300 мегадалтоновия, MD 1 = 1500 ВР). Тези мини-хромозоми, наречени плазмиди.

Обикновено, плазмиди са съставени от гени за антибиотична резистентност, йони на тежки метали (R-плазмиди), както и гени, които контролират катаболизма на някои органични съединения (плазмид биоразграждане или D-плазмид). Тъй като тези гени се намират в плазмиди, те са представени от много по-голям брой копия. Голям брой копия плазмиди осигурява клетка синтез на голямо количество ензими, антибиотици или химически неутрализиращи ксенобиотици, и който осигурява резистентност към последната. Плазмидите, очевидно навсякъде, тъй като те са изолирани от различни щамове и видове бактерии, но са допълнителни компоненти на генома, а в някои щамове на природни плазмиди не е намерен изобщо.

Тъй като ДНК плазмид е много по-хромозома, е много лесно да се изолират в чиста форма. В присъствието на плазмид калциеви йони се абсорбират лесно от бактерии на получателя, дори ако те никога не са били държани, и в клетките на бактериалната потомство може да се намери много копия на плазмид абсорбира. Въпреки това, обикновено бактериална клетка може да съдържа в структурата си един вид плазмид. Това явление плазмид несъвместимост. Има несъвместимост група - Inc-група (от английски несъвместимост - несъвместимост). В такава група може да бъде няколко плазмиди, които са съвместими един с друг, но са несъвместими с други плазмиди. Тези плазмиди са подобни на много симптоми и често значителна хомология ДНК.

Броят на плазмидни копия за клетка може да варира значително. Това зависи от генетичните характеристики на клетките и плазмида. Плазмиди са "под хлабав контрол", могат да се размножават, докато броят им достигне 10-200 копия на клетка. Ако плазмид е "строго контролирани", а се репликира със същата скорост като основен хромозома. Такива плазмиди, съдържащи се в клетката, в един или няколко екземпляра. Естествено, клонирането на рекомбинантни ДНК плазмиди са склонни да използват първия тип. Но това не е необходимо, тъй като плазмид, в присъствието на хлорамфеникол може да бъде умножена независимо от хромозомната разделение, както и броя на копията от плазмид може да бъде многократно увеличена.

Един от най-често използвани за клониране плазмиди PBR 322 се основава на естествено срещащи се плазмид, изолиран от Е.коли. Този плазмид съдържа гените на резистентност към два антибиотика: устойчивост спрямо ампицилин и тетрациклин, и гени на резистентност към тези антибиотици, има рестрикционни сайтове. Ако фрагмент на чужда ДНК е интегрирана в един от гените на резистентност, последният се инактивира. Следователно, успешното включването на ДНК фрагмент чужд в една от тези гени са лесно открити от изчезването на бактериална резистентност към този антибиотик. Но същевременно се поддържа устойчивост към други антибиотици. По този начин вектор позволява да се открие само бактериални клонове, които съдържат рекомбинантен плазмид.

Има вируси, които не водят до клетъчна смърт, но са интегрирани в генома на клетката гостоприемник и да се възпроизвеждат с него или да му неконтролиран растеж, т.е. се превърне в рак. Те включват ДНК-SV-40 и вирус полиома вирус. Въвеждането на някои тумор РНК вируси води до обещаващ на вирусни частици от клетъчен лизис без нея. Тези вируси включват, например, ретровируси (Rous саркома вирус и СПИН). За бактериални клетки като вектор са често използвани бактериофаги.

Вирусите са един от основните кандидати за ролята на вектори за въвеждане на чужда ДНК. Когато вирусна инфекция, всяка клетка може да получи голям брой копия на чужд ген. ДНК може да бъде поставена така, че е под контрола на силен вирусни промотори, които осигуряват високо ниво на експресия на гена и неговите продукти са по-широко достъпна за изследвания.

През последните години, множество предназначени "совалка" вектори, и техните рекомбинантни производни, които са способни на репликация в животинска клетка и бактериална и ефективно експресиране на клонирания ген в животинска клетка. Най-честите вектори се състоят от плазмид pBR322 и интактната ранен регион SV40 ДНК транскрипцията, генът е интегриран под контрола на промотор, или късни гени допълнително ранен промотор. Например, ген се вмъква в SV40 ДНК # 946; заек глобин, което се изразява в маймуна клетъчни линии, инфектирани с рекомбинантен вирус: синтезирана в клетки и глобин иРНК, и самия протеин.

Вирусът трябва да бъде жизнеспособна след рекомбинантна ДНК. Най-лесният начин да се въведе вируси в бактерии. Недостатъкът на вирусни вектори искал е техният малък капацитет. Освен това, вирусът заразява един малък кръг от собственици.

Има хибридни вектори, съдържащи ДНК на фага и плазмиди. Те включват, например, козмиди и фазмиди.

Космидите - плазмиден вектор, в които е интегриран фаг геном част # 955;, осигурявайки възможност за опаковане на ДНК молекулата в фаговата частица. Фаговите частици осигуряват добро проникване хибридна ДНК в клетката (чрез инжектиране) преди да се затварянето на пръстена ДНК лепливи краища и неговата репликация от типа на плазмид.

Плазмид също са хибриди между фаг и плазмид. След въвеждане на чужда ДНК може при определени условия да се развиват като фаги в други - като плазмиди.

От всички известни досега инфекциозни агенти имат ранг на повечето страни. Известно е, че най-малките вируси могат да независим репликация на генома имат размери, съответстващи на молекулно тегло от 1 М, която е около 1500 хиляди. Базови двойки. Той се счита за минимално количество генетична информация, необходима за кодиране на продукти и вирус-потискане клетка гостоприемник метаболизъм.

Въпреки това, през 1971 г. са отворени godu инфекциозни агенти, са много къса верига 1 верижна РНК, ковалентно свързан с пръстен, състоящ се от нуклеотиди 270-300 (три порядъка по-малко от най-минимално вирус) не затворена в белтъка на обвивката. Тази необичайна патогени - най-простите и най-малката от всички известни.

Как вироиди провокират симптоми на заразените растения, като не е известно досега. Установено е, че те повторен ензимите на клетката гостоприемник, не се излъчват в полипептиди видове специфично са интегрирани в генома на клетката гостоприемник.

Вироиди заразят persisitentno (възстановяване не се случи). Причина системна инфекция, т.е. мигрират от мястото на въвеждане в други части на растенията се прехвърлят механично или чрез сок клетка чрез семена, полен. Вирусоподобните също са свързани с ядрени фракции от растения и могат да растат в ядрата.

Когато се работи с вирусоподобните, едно-верижен ДНК копие на РНК комплементарна верига и се завърши за да се получи 2-верижен ДНК вирусоид. Такова 2-vctraivaetsya ДНК в плазмид и се прехвърля в Е. Coli клетки за клониране. Четене започва с генен промотор, който се разпознава от РНК полимераза, отговорен за транскрипцията на ДНК в РНК матрица. Обикновено, този ДНК фрагмент 41-44 вр. Джийн се чете от ляво на дясно, от 5 'към 3' края на гена, и завършва в края област на гена. За промотор транскрипционното стартово място започва, последвано от семантична част на гена. Промоторният участък на гена съдържа комбинация от някои кратки нуклеотиди, специфични за бактериални гени или гени на висшите организми. Такива комбинации са сигнали за РНК полимераза, която се присъединява към промотор част на гена и започва да го прочете.

На едноверижна и двойноверижна ДНК може да инициира вирусоид репликация в тютюневи растения се инокулират механично. Ин витро ензимно синтезира РНК като вирусоподобните, силно заразен с растения. Векторни системи могат да бъдат проектирани на базата на самата РНК, базирани viroidospetsifichnyh ДНК, както и в комбинация с Ti viroidospetsifichnyh ДНК -plasmids. Вироиди заразят своите домакини по време на жизнения си цикъл, така че в случай на вирусоид векторни системи могат да се очакват постоянен израз на чужд ген в растението.

Както векторите могат да бъдат използвани opuholeobrazuyuschie бактериален плазмид. видове Agrobacterium на еволюционно свързани възлите бактерии, принадлежащи към род Rhizobium и имат много общи черти с тях. Въпреки това, естеството на взаимодействието с Agrobacterium растението има специфични характеристики.

Взаимодействие вида Agrobacterium за растенията е от особен интерес, тъй като при този тип паразитизъм един партньор специално променя свойствата на гостоприемника чрез вмъкване на техните гени в своя геном. В допълнение, той служи за уникален пример на прокариотна ДНК миграция в еукариотна клетка. Митохондриална ДНК и хлоропластен, хлоропласти и митохондрии съдържат пълен генетична система, т.е. всички компоненти, необходими за експресията на генетичната информация: ДНК, ДНК полимераза, РНК полимераза и машината протеин-синтезиране (рибозоми, тРНК, аминоацил-тРНК синтетаза).

Хлоропластен и митохондриалната ДНК също привличат вниманието на учените като възможни вектори за генен трансфер в клетката. Структурната организация на тези клетъчни subgenomes варира значително.

Хлоропласти и други пластиди имат една и съща генетична информация, така наречения пластом. В висши растения, е затворен ДНК молекула от 150 м. Н. п., достатъчно да кодира протеини на около 100. За синтеза на пластид протеинът трябва да бъде значително по-голяма. Останалите протеини са кодирани от сърцевината, се синтезират в цитоплазмата и влиза хлоропластите. Някои от основните хлоропласт протеини са съставени от няколко подединици, някои от тях са синтезирани на рибозоми на цитоплазмата и се транспортира в хлоропласта, когато са комбинирани с други полипептиди, кодирани в хлоропласта и в същото синтезирани. По този начин, за биосинтезата на функционално активен хлоропластен геном изисква координиран изразяване и пластом.

Различни видове пластиди съдържат неравно брой идентични копия на пластом: 10 - 20 копия в пластидите на корени и зрели хлоропласти до стотици копия в младите картофени хлоропластите. Такова ниво усилване дава надежда за по-надежден израз на чужда ДНК, като ги използват като вектори в генното инженерство експерименти. Освен това, на пластид рибозомна РНК гените и голямата субединица на Rubisco кодирани хлоропластен геном. Може би въвеждането на силни промотори в тези гени и допълнителна модификация на техния значителен ефект върху фотосинтетичния активността на растителната тъкан.

Растителни гени, също са способни на експресия в клетки на Е. коли. Това е чудесен гени subedintsy Rubisco. Хлоропластен гени предимство се състои в това, че тяхната експресия в клетки на E.coli, може да се постигне само чрез комбиниране транскрибирани секвенции, като ДНК в хлоропласти и бактерии, преди началото превод кодон е идентична нуклеотидна последователност. Това прави възможно да се синтезира икономически важни растителни полипептиди използват прокариотни клетки.

За разлика от хлоропласта, митохондриална ДНК се характеризира с изключително разнообразни и тяхната стойност варира от 200 до 2400 m. Н. п. Въпреки това, няма връзка между размера на митохондриален геном и броя на протеинови продукти, синтезирани от изолирана митохондрии, не са наблюдавани. Това явление, както и голям размер на митохондриална ДНК, както изглежда, може да бъде обяснено с наличието на ДНК, безполезен за функционирането на митохондриите.

Като част от митохондриална ДНК са структурните гени, кодиращи полипептиди, гени, рибозомна РНК и прехвърляне. Въпреки това, повечето от протеините на митохондрии, хлоропласти като кодиран от ядрени гени. Но ако геном хлоропластов е представена от хомогенна популация на големи молекули пръстен в митохондриите съдържа няколко класа на пръстеновидни молекули, не всички функции са все още неясни.

В митохондриална геном на живите организми е много по-ниска 15-19 М Н .. стр., и е по-консервативна структура. Митохондриални гени кодират две групи от символи - работа дихателни системи и резистентност към антибиотици и други отрови. В митохондриална генома на растението има и гени за признак на мъжка стерилност цитоплазмата.

Транспозоните - ДНК сегменти, които контролират собствената си транспониране (движение) на ДНК от едно място на друго чрез изрязване от оригиналния сайт и въвеждане на нов сайт на хромозомата или плазмид. За първи път е открита през 40-те години американски учен Барбара МакКлинток в царевицата. Тези гени indentifitsirovannye за способността им да потискат експресията на други гени от царевица, в близост до тях, не трябва фиксирана позиция в хромозомата. Изглежда, че те да бъдат преместени в цялата генома на растението. Регулаторните елементи могат да бъдат вградени и отцепени и след изрязване често започва да функционира по-рано мълчаливи гени.

Установено е, че гените, свързани с регулаторни елементи стават нестабилни и често са мутирали заради нестабилността на самите тези елементи. Царевицата е единствената система, в продължение на много години, което открива тези подвижни генетични елементи. Сега - и в бактерии, Drosophila и други организми.

Механизъм на движение на ДНК фрагменти в генома не е напълно изяснен. ДНК се прехвърля чрез ензим транспозазата на. Ензимът е кодирана от последователност от около 20 нуклеотида в средата на транспозона. Той специфично взаимодейства с крайните обърнати повторения на мобилни елементи и може да го изрязани от хромозомата. Рязане може да се извърши точно - с възстановяване на първоначалната структура на частта от ДНК и неточно, т.е. делеции и инсерции на един до няколко нуклеотида. Това води до появата на устойчиви мутации и един от създаване на нови механизми ДНК последователности.

Обикновено мобилни генетични елементи повтаря много пъти в генома и образуват хетерогенна фамилия, чиито членове са диспергирани в хромозомите. Повечето от членовете на всяко семейство са дефектни копия и не кодира всяка функция, но запазват способността си да се движат. Поведението на транспозони може да се разглежда като паразитни. Тяхната дължина е от 2 до 10 tysyach нуклеотидни двойки. В по-висши еукариоти, транспозони да представляват приблизително 10% от ДНК на клетката. Повечето от тях се премества от време на време, но, тъй като клетката им много, транспониране има значително въздействие върху видовото разнообразие.

Биологичната значимост на движение на отделните ДНК сегменти:

- прекъсване на гена, което води до развитие;

- Регулиране на генна активност, тъй като транспозони може да пренася сигнали за начало показания гени. В нови области засили или да забрани дейността на ген.

Транспозоните също участват в хоризонтален генен трансфер.

В бактерии, 2 клас на мобилни гени са били идентифицирани, които се различават по дължината и сложността на организацията.

1. вмъкване последователности или 1S елементи с дължина около хиляда нуклеотидни базови двойки и съдържащи само на гена, отговорен за тяхното движение.

2. транспосони и дължина от 3 до 20 м. Н. п., състояща се от редица допълнителни гени, участващи в бактериална резистентност към различни токсични вещества.

Тъй като движещи гени могат да се движат в рамките на генома от едно място на друго, те могат да бъдат много ефективни вектори за прехвърляне на рекомбинантна ДНК. Генетична трансформация с вектори на базата на транспозони първо се провежда на Drosophila. Използване на Drosophila преносим елемент P беше прехвърлен ген, който произвежда кафяв цвят на очите. Генно прехвърляне с помощта на транспозони има големи предимства, както това се случва с висока честота и не включва значителни размествания интегрируеми ДНК. Освен това, този метод може да се движи достатъчно големи ДНК фрагменти.

Други глави в този раздел: