Gene Cloning - процедура, включително избора и амплификация на специфични гени в реципиентни клетки, прокариотни и еукариотни. Клетките, съдържащи желания ген могат да се използват за: а) голямо количество протеин, кодиран от гена; б) голям брой на гена в силно пречистена форма.
процес ген клониране включва няколко стъпки:
1. Получаване на желания ген:
а) чрез смилане на геномна ДНК с рестрикционни ензими (ендонуклеази, които разцепват ДНК молекулата в определена точка);
б) чрез химичен синтез само малки ДНК фрагменти (от познаването на последователността на аминокиселинни остатъци в молекулата на протеин, винаги е възможно да се определи последователността на нуклеотиди в ДНК фрагмента, кодиращи протеин съгласно генетичния код). По този начин, чрез химичен синтез се получава от ген, отговорен за синтеза на соматостатин;
в) от телесни клетки, изолирани тРНК молекула и с помощта на ензима обратна транскриптаза (РНК-зависима ДНК полимераза в а) се освобождава от защита ДНК копие на желания ген. Например, остров панкреаса клетки се изолира иРНК провеждане информация за синтез на инсулин. А от клетки, инфектирани с вируси, изолирани и РНК, който носи информация за синтеза на интерферон.
2. Въвеждане на избрания или получени ДНК фрагмент във вектор ДНК молекулата - получаване на рекомбинантна ДНК. Vector - нещо като молекулярен "такси", способен да пренася чужда ДНК в бактериалните клетки, така че да могат да бъдат копирани там. Има два основни типа на вектори бактериални плазмиди (често отговорни за устойчивост на две или повече антибиотици) и дефектни умерено (в състояние да приложи трансдукция) бактериофаги.
Плазмидът се смила с рестрикционен ензим в строго определено място. След разцепване на своите краища, като краищата за клониране на избрания ДНК с терминална трансфераза "doraschivat", така че крайните части на плазмидите са вградени комплементарна ДНК (или друг каже "лош вкус"). Освен това, поради взаимодействие "лепкави" последователности и с помощта на специални ензим ДНК лигаза се извършва омрежване (лигиране) и вложка ДНК на плазмидна ДНК. Полученият нов кръгова ДНК молекула се казва, че рекомбинантната ДНК.
3. Въвеждане на рекомбинантна ДНК на клетката-получател. Клетките бяха избрани за генна клониране могат да бъдат про- така и еукариотни. Най-често използвани за тази цел бактерии защото тяхната култура не е голям проблем (Е. коли, Б. субтилис и др.). Но ако генът се изолира по метода 1, трябва да се клонира в еукариотни клетки, такива като дрожди. Въвеждане на рекомбинантна ДНК се извършва чрез трансформация (пропускливост на бактериалната клетъчна стена се увеличава в разреден разтвор на калциев хлорид) или трансдукция (в случай на използване като бактериофаг вектор).
4. Избор на трансформираните бактерии. Тъй като не всички от бактериални клетки се трансформират с реакционната смес, е необходимо да се направи избор на клетки, съдържащи рекомбинантна бактерия. Изборът обикновено се основава на факта, че плазмидите придават устойчивост към някои антибиотици, и следователно бактериите съдържащи плазмид ще репликират в присъствието на подходящ антибиотик.
5. Култивиране на трансформирани клетки. Култивиране избрани клетки, необходими за растежа на биомаса за амплифициране на гени в клетките реципиенти.
6. Изолиране на протеин или генен продукт на добавя изолирането на ДНК от пречистени плазмиди.
Получаване на моноклонални антитела (моноклонално антитяло)
Основните методи на съвременната техника клетка - хибридизация (или химерни) и възстановяване на клетката. метод клетъчна хибридизация ви позволява да комбинирате клетките дори напълно различни микроорганизми, както и растителни клетки, животни и хора.
Клетъчно сливане се извършва или чрез третиране на клетките с полиетилен гликол, или действието на къси електрически импулси. Получените хибридни клетки - хибридоми - имат два комплекта хромозоми и съчетават свойствата на двете "майки" клетки.
През 1974 г., Keller Milstayn и хибридизация на нормални лимфоцити от далака на имунизирани мишки с миши миеломни клетки. слят продукт на антитяло към туморни клетки - хибридоми, произвеждащи антитялото от една специфичност (един антигенна детерминанта) и способен на неограничен растеж ин витро.
ICA широко използвани за диагностициране на много бактериални и вирусни инфекции (хепатит В, грип, херпес, бруцелоза); определяне на тъканни антигени, рецептори и медиатори лимфоцити; за диагностика и лечение на злокачествени тумори (ICA създаден които реагират със специфични Аг рак на белия дроб, гърдата, дебелото черво, панкреас).
Теми на доклади за конференция за обучение
1. Историята на развитието на биотехнологиите.
2. Биотехнологии и резолюция от екологични проблеми.
3. Биотехнологии: нови възможности за диагностика и лечение.
4. Нови медицински препарати.
5. Възможности и перспективи за генното инженерство.
Свързани статии