В молекулно клониране на желания вмъкване е ДНК фрагмент към друга ДНК молекула, която е способна на репликация (информация, кодирана в родителската ДНК базова последователност се предава с филиал точност ДНК) в подходяща клетка гостоприемник. Молекулите на ДНК, използвани за прехвърляне на материала в вградени бактериалните клетки, наречени вектори. Това вмъкване се извършва ин витро, и след това полученият рекомбинантен ДНК се въвежда в клетки.
Вектор молекула трябва задължително да съдържа произход на репликация - Ori. Освен това, необходимостта да се реплицира специфични ензими и помощни протеинови фактори. Тяхната източник е клетката гостоприемник или те са кодирани от вектора. Векторът може да бъде всеки малък екстрахромозомен елемент - плазмид, фаг или ДНК вирус ДНК, козмиди, фазмиди.
Най-широко използваната такава комбинация, когато в основната роля подава Е.коли К12 щам и ролята на вектора - различни плазмиди и фаги Е.коли. Предпочитаното използване на щама се дължи на факта, че точно в Е.коли К12 клетки безпрепятствено повтаря много бактериофаги и плазмиди, които могат да бъдат използвани като потенциално полезни вектори, и този щам е най-проучвано.
Klassifikatsiruyut плазмид глава накъде наличието в тях на модулни сегменти на ДНК. Всяка модулна сегмент може да съдържа един или повече гени или цис -action елементи като например локус Ori. Всеки плазмид трябва да има поне един репликация модул, който ще му даде възможност да възпроизвежда активно в клетката реципиент. Присъствието на други модули, различни от репликацията, не се изисква за всеки плазмид.
Сексуални фактори konyugativnymi наречени плазмиди. (Например F-плазмид) са конюгиране модули, съдържащи гените и регулаторни региони, необходими за прехвърляне плазмид от една клетка към друга. Някои от nekonyugativnyh плазмиди (без конюгиране модул) могат да се прехвърлят от една клетка към друга, ако те са комбинирани в донор клетки с фактор пол.
Модулите съдържат различен тип гени, протеинови продукти, които осигуряват инактивиране на антибиотици. Плазмиди, носещи тези модули, често се нарича R-плазмиди (от английски съпротива. - Resistance). Често един плазмид придава устойчивост на няколко антибиотици, и няколко или дори всички гени за устойчивост на могат да бъдат групирани в един модул различни видове.
Има и друг тип модули, който се намира в състава на колко konyugativnyh и nekonyugativnyh плазмиди - това колеги модули. Col-модули са гени, кодиращи един от няколко протеини - colicins - антибактериални средства, произведени от бактерии. Колицин различават по структура и механизъм на действие. Много често колеги плазмиди, кодиращи определен колицин съдържат гени за имунитет към него колицин, като по този начин защитава клетката на производителя срещу щети, причинени от собствените си средства за защита.
Плазмидите първоначално са били открити в природата, са впоследствие модифициран, скъсен, и се подлага на рекомбинация реконструиран както ин виво, и в условия ин витро. Целта на всички тези манипулации е да се получи универсални плазмиди или, алтернативно, плазмиди, насочени към овладяване някои специфични експериментални проблеми. Повечето от тях съдържа генетични маркери за опростяване на избора на бактериалната клетка, която включва рекомбинантна молекула.
Освен факта, че генетичните маркери се използват за разграничаване на клетки на бактериални клонове, съдържащи рекомбинантния плазмид, те изпълняват друга важна функция. Ако плазмид при определени обстоятелства не изпълнява своята функция, клетките са склонни да растат и да се размножават по-ефективно при липса на "екстра" екстрахромозомална ДНК. Поради това, тези клетки, които губят плазмид бързо израстват други, с бинанти са елиминирани. В противен случай, ако клетките са в условия, при които оцеляването им зависи от плазмиден вектор на изгубени клетки са елиминирани.
Свойства на идеална плазмид вектор. Идеален плазмид вектор за молекулярно клониране, трябва да отговарят на следните изисквания:
1. вектор трябва да съдържа минимално количество на ДНК;
2. репликацията на вектора трябва да се регулира от вида на атенюиран - (което води до появата на много клетки плазмидни копия) и не строг контрол, за да се осигури висок добив на ДНК;
3. Векторът трябва да съдържа най-малко два избираеми маркери и има място за разпознаване на рестрикционната ендонуклеаза. Последното свойство ви позволява да се намали кръглата ДНК в един уникален сайт, на който впоследствие извърши лигиране с вложка;
4. за максимална лекота на избиране на трансформанти, уникален рестрикционен сайт трябва да бъдат разположени в един от двата селективни маркери;
5. Вложката не трябва да се прекъсва последователността е необходимо да се запази по-голямата част плазмид.
От всички вектори, когато се работи с Е.коли, най-популярната плазмид pBR322. Този плазмид има много свойства на идеален вектор за клониране. Тъй като pBR322 повторен Col тип Е1 (Col-Е1 е плазмид, който е в състояние да се натрупват няколко хиляди копия на плазмид геном, дори когато клетката расте и не се разделя), ДНК плазмид може да се получи с висок добив. Плазмидът съдържа две селективен маркерен ген, придаващ резистентност към тетрациклин и ампицилин. Всяка от места за разпознаване на ензим 12 рестрикционни в молекулата се намира само веднъж, което позволява да се получат различни линейни молекули с "лепливи" краища. Известен пълната нуклеотидна последователност на дължината вектор от 4362 базови двойки.
Клетките на E.coli. съдържащ плазмид pBR322, се отглеждат в среда с ампицилин или тетрациклин, или в присъствието на антибиотици, така и клетките, които са загубили плазмида не растат в присъствието на или антибиотик. Ако ДНК фрагмент се въвежда в pBR322, отговорен за резистентност към тетрациклин (например рестрикционно място Bam HI или Sal I), след това тези трансформанти запазват способността да расте върху среда с ампицилин но не растат в среда, съдържаща тетрациклин. Ако въвеждането настъпва ампицилин ген (за сайтове на рестрикция Pvu I или Pst I), се наблюдава обратната ситуация. Във всеки локализация поставете лесно извършване на избор на само тези бактериални колонии от клетки, които носят рекомбинантна плазмидна ДНК.
молекула ДНК от фага л, състояща се от 48502 нуклеотидни базови двойки, включва начало на репликация, както и гени, кодиращи вирусни структурни протеини и ензими, необходими за репликацията на ДНК, лизис на инфектираните клетки и да се установи lysogeny. Приблизително 30% от генома е представена от област ненужни за спадаща инфекция. Като правило, много или дори всички гени, необходими за lysogenesis отстранява, така инфекция Е.коли рекомбинантен вектор винаги е придружен от лизиране на клетките гостоприемници.
М13 фаги влиза група ресничестите бактериофаги E.coli в. Фаг геном съдържа едноверижна кръгова ДНК участва. опаковани в капсид. М13 фаг е способен да инфектира клетки T.coli само ако те притежават F-пили.
Такива хибридни вектори включват козмиди и фазмиди.
Козмидни - тип хибридни вектори, които се характеризират с вида на плазмидна репликация и притежават способността да бъдат опаковани в условия ин витро в фаг глава л. Типични козмид съдържа произход на репликация включва уникални рестрикционни сайтове и селектируеми маркери, принадлежащи плазмидна ДНК, която е интегрирана с ДНК фрагмент от фаг л, съдържащ фагови "лепливи" краища (COS -cayty). клетките на реципиента гостоприемник стават опаковани в вириони козмиди, причинени от инфекция с "фалшиви" фагови частици. След като в клетка, рекомбинантна ДНК се амплифицира и се съхранява в него под формата на плазмиди.
Космидите са по същество плазмидни вектори, които имат само защото -cayt фаг л, необходими за ефективно опаковане на рекомбинантна ДНК ин витро.
Истинските хибридни плазмиди и фаги са фазмиди - линеен дуплекс ДНК молекула, които са разположени в краищата на ДНК сегменти на фаг л, съдържащи всички гени, необходими за литична инфекция, докато средната част показва линеаризиран плазмид. Репликация функции като фаг или плазмид в плазмид напълно запазени. Обикновено, такива вектори съдържат няколко повторения на плазмид част на гарантиране изисква за опаковане на геномна ДНК дължина. Един или повече повторения на плазмид в изграждането на рекомбинантна ДНК заменят съответния вложката.
Преди инфекция Fazmidnye ДНК опаковани ин витро като фаг. След като в клетка Е. коли. плазмид ДНК се реплицира като фаг, в резултат на тревата на чувствителни клетки образуват плаки. Въпреки това, ако векторът съдържа ген, кодиращ репресор на фаг л, плазмид след това се реплицира като плазмид, а не като фаг.
Свързани статии