Полимеразна верижна реакция
Полимеразна верижна реакция (PCR) - експериментален метод биохимия да се постигне значително увеличение на малки концентрации на някои fragmentovDNKv биологичен материал.
В допълнение към усилване (увеличение в броя на копията) на ДНК, PCR позволява много други манипулации на нуклеинови киселини (въвеждане на мутация, снаждане ДНК фрагменти) и се използва широко в биологична и медицинска практика, например, за диагностициране (генетични, инфекциозен), бащинство, dlyaklonirovaniyagenov, разпределение novyhgenov.
В началото на 1970 godovnorvezhskomu uchenomuHellyu Kleppeiz лаборатория на Нобелова laureataHara Гобинд Horanyprishla идеята, че е възможно да се амплифицира ДНК с помощта на чифт къси едноверижни ДНК молекули - sinteticheskihpraymerov.
Докато тази идея остава непотърсени. Но през 1983 г., тя е изпълнена успешно Кари Мълис.
Неговата цел е да се създаде метод, който би позволил amplifitsirovatDNK време posledovatelnyhudvoeniyiskhodnoy множество ДНК молекули чрез fermentaDNK полимераза.
Методът на PCR се базира на естествения процес - удължаване от комплементарна ДНК матрица, извършена от ензим ДНК полимераза. Тази реакция се нарича ДНК репликация.
естествена ДНК репликацията на включва няколко етапа:
1) денатурация на ДНК (деспирализиране на двойно спирална ДНК нишки отклонение);
2) Получаване на къси двойноверижна ДНК сегменти (праймери, необходими за започване на синтеза на ДНК);
3) Синтез на нова ДНК нишка (комплементарна разширение от двете вериги)
Carey Mullis показа, че този процес може да се използва за получаване на копия на къси участъци от ДНК, които са специфични за специфични организми, т.е. да извърши целенасочена търсене за тези специфични области.
За производството на денатурация на ДНК, тя се нагрява.
В началото на метода, след всеки цикъл на нагряване - охлаждане, е необходимо да се добави нов част от реакционната смес ДНК полимераза, тъй като тя бързо се инактивира при висока температура, необходима за нишка разделяне на ДНК спирала. Процедурата е много неефективно, изисква много време и ензими.
През 1986 godumetod полимеразна верижна реакция е значително подобрена. Предложено е да се използва ДНК полимерази от термофилни бактерии. Тези ензими са термично стабилни и могат да издържат на различни реакционни цикъла.
Тяхната употреба е възможно да се опрости и автоматизиране на PCR. Един от първите термостабилна ДНК полимераза се изолира от Thermus aquaticus бактерии и име Taq полимераза. Недостатък на този полимераза е, че вероятността за получаване на неправилни нуклеотиди в него е достатъчно висока, тъй като този ензим е не коригиране на грешки механизми (3 '→ 5' ekzonukleaznayaaktivnost).
Pfu полимераза и Pwo. получен от археи има подобен механизъм, тяхното използване значително намалява броя на мутации в ДНК, но тяхната скорост на работа (производителност,) по-ниска от uTaq. Сега се прилага смес от Taq и Pfu. за да се постигне едновременно по-висока скорост на полимеризация и висока точност копиране.
Свързани статии