• моторни протеини са активни в клетъчни екстракти. Това ви позволява да ги разпредели в пречистена форма

• моторни протеини, прикрепени към стъклото и осигуряват повърхност за плъзгане микротубулите

• мъниста - мъниста, покрити с моторни протеини, могат да бъдат транспортирани на микротубулите

• Използване на микротубулите на маркировките за поляритет, че е възможно да се определи в каква посока се движи на мотора

Откриването и изолиране на микротубулни моторни протеини са свързани с развитието на нови техники, които позволяват на изследователите да изучават им подвижност в екстракти на клетки ин витро или чрез използване на пречистени препарати на протеин двигатели. С откриването на кинезин доведе наблюдение на преместване везикули в суровия екстракт клетките - същество неразреден цитоплазма - приготвени от един гигантски аксон на сепия.

Аксона е обект перспектива да се намерят такива молекулни мотори, защото на неговите силни микротубулите движение се осъществява везикули. Огромният аксона на сепия се отделя от тялото, и от екструдиран цитоплазмата (или axoplasm както предпочита да нарича невролози), което е за наблюдение на движение се поставя върху предметно стъкло. Чрез фракциониране axoplasm и подвижността проучвания всяка фракция Рон Вейл и сътр. изолира първите кинезин двигателите.

За разлика от традиционните биохимични изследвания. се извършват в епруветки, мобилност изследва под микроскоп, който ни позволява да се проследи движението на която е снабдена с мотора. Как под микроскоп да наблюдавате активността на двигателя? С цел да открива движение, е необходимо да се следват обекта във времето. В този случай трябва да бъдат естествени протеини. При прилагането на електронна микроскопия е изключено.

Последното изисква грубо химическа обработка на пробите, които инактивират протеини. Светлинна микроскопия има такава висока резолюция като elektronnnaya, но има предимството, че това обикновено изисква по-малко сурови проби за обработка или никакви искания. Следователно, може да се използва за изследване на процеси изискват активни протеини и която продължава няколко минути или по-дълго. Въпреки това, микротубулите са твърде малки, за да бъдат свързани с тях мобилност може да се види с обикновен светлинен микроскоп.

Изображение микротубулите получени с използване на DIC-микроскопия последвано от компютър аксесоар.
Картината изглежда зърнеста, но ясно показва позицията на микротубулите и неговата дължина.
С този метод е възможно да се измери дължината на микротубулите, следи за мобилност и транспортните процеси, в които те участват.

Интересното е, че за изучаване на протеин мобилност моторен товарен се изисква. Това е така, защото, за разлика от микротубулите, протеинови двигателя са свързани със стъклени повърхности (на микроскопа и стъклен капак). При свързване към стъклото само двигателите, тяхната дейност дава възможност на микротубулите да се движи по повърхността. Подходящи примери, представени на фигурите по-долу.

Тест микротубулите изместване се използва за проучване биохимични фракции, които са получени чрез почистване на първия кинезин. Този тест обикновено се използва за изследване микротубулни моторни протеини. В един от неговите модификации използват стъклени или латексни перли, покрити с протеин двигатели, и тяхното движение се наблюдава на микротубули.

Този "тест businochnaya" малко по-сложно, защото на мъниста и микротубулите трябва да се спазва със светлинна микроскопия. Във всички случаи, първият стабилизиране на микротубулите, като им свързване с паклитаксел.

Характерна особеност на протеинови двигатели е, че те са в състояние да се движат по микротубули само в една посока. С цел да се определи дали мотора към плюс или минус крайните движи, трябва да vysyanit как определя от полярността на микротубулите. Един от начините за определяне на полярността, първо събрание включва радиални микротубулни структури за изолирани центрозомите, а след това ги фиксиращи върху предметно стъкло. След това тя се прилага за стъклени мъниста и да гледат на тяхното движение.

В същото мъниста. покрити с протеин двигател, които се движат в центъра на структурата, се премести в края на минус, и тези, които се движат от центъра, преминете към плюс края. Друг начин за отбелязване на полярността на базата на микротубулната полимеризация по-бързо плюс-край. първо за тест къси микротубулите образуват много висок процент на субединици, съдържащи флуоресцентна сонда. Тези ярко светещи микротубулите след това използвани като зародиши центрове вече mikriotrubochek в разтвор, съдържащ много по-нисък процент на флуоресцентен тубулин.

Тубулиновите молекули са добавени към двата края на центровете за тръби зародиши, но много по-бързо до плюс края. Резултатът е набор от микротубули с един къс, много светло част в средата, и тъпа, но видими части на краищата. Начертайте плюс край gorazo-дълго, отколкото отрицателен край, което веднага дава възможност за определяне на полярността на микротубулите. Тези флуоресцентни микротубулите на маркировките на полярност могат да бъдат използвани за определяне на мобилността, за да се определи посоката на движение. е важно да се помни, че протеиновите мотори са фиксирани при тълкуването на експериментални резултати.

Когато двигателят се движи в посока на на микротубулите плюс клас ще се движат напред към своя край минус. Почти всички методи за определяне на подвижността са варианти на тези тестове. Естеството на целите, подробности за експериментални устройства и позволяват на системата за откриване може да бъде различен, но основният принцип остава същата.