След ДНК се омрежен ин витро, е необходимо да се реплицира, т.е. клонинг. Цел: да се получи множество копия на желаните гени. За клониране на малки ДНК фрагменти, или плазмиди, фаги ДНК за голям - козмиди и изкуствени хромозоми.
Има два подхода към клонирането на ДНК:
1) използването на бактериални или дрождени клетки се размножават въведени в него чужда ДНК.
2) амплификация на ДНК ин витро.
Използване на микроорганизмите може да създаде два вида ДНК библиотеки: и геномен клон (сДНК библиотека).
Геномна библиотека (GenBank, klonoteka) - събиране на ДНК клонове, включително всички фрагменти, принадлежащи към генома на вида. Д. генетична банка все още може да се нарече набор от клонирани геномни фрагменти. Ако генома на организма да се намали, поставете в плазмид или вирусен вектор и се въвежда в клетката, може да се съхранява в тази форма. При рязане плазмид или фаг ДНК вероятността от цели и непроменени части от генома е доста висока.
Този метод за получаване на геномна библиотека, наречена "пушка секвениране", тъй като в този случай генът съдържа отделни фрагменти.
Принципи за създаване на плазмид и вирусни вектори като цяло, така че можем да ги примера на плазмид разгледа. От вирусната ДНК е по-добре да се използват фагови ДНК, тъй като те имат по-голям капацитет и ще направи възможно да се вмъкне по-големите парчета на генома.
За създаване на генна банка трябва да:
1) изолиране на цялата геномна ДНК
2) фрагментиране на ДНК с рестрикционни ензими или ултразвук
3) Пречистена кръгови ДНК молекули (вектори), лекувани със същия рестрикционен ензим за получаване на линейна ДНК. Клетъчната ДНК се добавя към плазмида в присъствието на лигази. Така получен рекомбинантен плазмид DNA
4) rekDNK въвежда в бактериални или дрождени клетки, където плазмид се повтарят за да се образува много копия.
5) Клониране на бактерии: Всяка колония стана клетки е клонинг на една клетка или потомство. Плазмидите, съдържащи единична колония клон геномна ДНК и плазмиди, определени форми на геномна ДНК библиотека.
Недостатък. ДНК фрагменти се произвеждат в големи количества. Рязане случай на геномна ДНК се определя, така че само част от фрагментите съдържат пълни гени. Някои фрагменти могат да съдържат само част от ген или интронни последователности.
Предимство: ген библиотека могат да бъдат съхранявани и използвани за неопределено време.
-източник на материал за изследване на структурата, функцията и регулирането на отделни гени, протеин структурата и функцията
-съхраняване на генетичния фонд на застрашени видове
Подобни сбирки, получени от отделните хромозоми или части от тях, наречени хромозомни библиотеки.
Свързани статии