DNA Cloning - използването на рекомбинантна ДНК технология за изолиране и размножаване на определена нуклеотидна последователност, съдържаща се в сложна смес от ДНК фрагменти. За тази цел първоначално цялата смес от ДНК фрагменти се въвежда в клониращ вектор. след това чрез скрининг, избран измежду тези рекомбинантни молекули, съдържащи ДНК фрагментът мишена, например. ген. и след това се изпълняват размножаване чрез въвеждането на избран рекомбинантна ДНК в подходяща клетка гостоприемник напр. клетката на Е.коли.

ДНК клониране включва 6 етапа:

1) получаване на ДНК фрагменти, включително гени, или части от тях с рестрикционен ензим;

2) рекомбинация на фрагментите

3) вкарване на ДНК фрагмент във вектор;

4) трансформация с вектор на организма гостоприемник;

5) Скрининг за рекомбинантния вектор

6) избиране на клонинги на интерес за изследователите.

Рестрикционни ензими. Ограничаване. Ендонуклеазата.

Във всяка човешка хромозома, има само една непрекъсната нишка на ДНК. Той е пълен с усилено, за да се вмести в хромозома. Манипулирани ДНК молекула от тази дължина е практически невъзможно.

Следователно, откриването на 70-те години на XX век. специални бактериални ензими. намаляване на ДНК в фрагменти, че е много удобно. Ензимите са наречени рестриктази или ендонуклеази.

В бактерии, тези ензими се използват за защита срещу проникване на чужда ДНК в клетка. Обикновено рестрикционния ензим признава т.нар палиндромната последователност от нуклеотиди, наблюдавани в двете вериги на ДНК и се състои от 4-6 нуклеотида.

генното инженерство

Методите за клониране на ДНК

След ДНК се омрежен ин витро, е необходимо да се възпроизведе.

Има два подхода за клониране на ДНК. Първият подход включва използването на бактериални или дрождени клетки се размножават въведени в него чужда ДНК. Вторият метод е ДНК амплификация ин витро.

Клониране на ДНК ин виво

Използването на микроорганизми може да създават два вида ДНК библиотеки: геномни и клонални.

Генната банка. Ако генома на организма да се намали, поставете в плазмид или вирусен вектор и се въвежда в клетката, може да се съхранява в тази форма. При рязане плазмид или фаг ДНК вероятността от цели и непроменени части от генома е доста висока.

Този метод за получаване на геномна библиотека, наречена "пушка секвениране", тъй като в този случай генът съдържа отделни фрагменти.

Принципи за създаване на плазмид и вирусни вектори като цяло, така че можем да ги примера на плазмид разгледа. Трябва да се отбележи, че тъй като на вирусната ДНК е по-добре да се използват фагови ДНК, тъй като те имат по-голям капацитет и ще направи възможно да се вмъкне по-големите парчета на генома.

Пречиства кръгова ДНК молекула се обработва с рестрикционен ензим за получаване на линейна ДНК. Клетъчната ДНК се третира със същия рестрикционен ензим, плазмид се добавя, добавя лигаза. Така получен рекомбинантен плазмид ДНК, която се въвежда в бактериални или дрождени клетки. Плазмид репликира и образуват множество копия. Много плазмиди носят ген за резистентност към антибиотици, и ако рекомбинантния плазмид е ген, клетките бяха лесно идентифицирани чрез отглеждане в среда с антибиотик.

Всяка колония е потомство или клонинг на една клетка. Плазмидите, съдържащи единична колония клон геномна ДНК и плазмиди агрегат може да се нарече геномна ДНК библиотека. Недостатък на този метод е, че ДНК фрагменти се произвеждат в големи количества. Рязане случай на геномна ДНК се определя, така че само част от фрагментите съдържат пълни гени. Някои фрагменти могат да съдържат само част от ген или интронни последователности.

кДНК библиотека. Осъществяване сДНК синтез започва с RNA шаблон чрез обратна транскриптаза комплементарна ДНК верига. След създаване на основни условия унищожи РНК нишка на нуклеотиди, след това се използва ДНК полимераза синтезира комплементарна ДНК верига. Това представлява ДНК фрагмент с тъпи краища. Тази ДНК се вмъква в плазмида и се въвежда в бактериална клетка. Когато амплификацията плазмид генерира допълнително копие от ДНК клон.

Предимства за клониране на ДНК клон геномна ДНК, която кодира протеин, нуклеотидната последователност на гена не прекъсва.

Гените на еукариоти съдържат интрони, които трябва да бъдат отстранени от transkriptnoy РНК преди превръщането му в матрица, последвано от съединяване. Бактериални клетки не могат да извършват такава модификация на РНК, образуван от транскрипцията на гена на еукариотна клетка. Ето защо, ако преследва препарат протеин чрез експресия на клонирания ген, е добре да се използва сДНК библиотека получава въз основа на РНК.

Restriktsiya- лигиране

В класически методи на рестрикция и лигиране, клониране на ДНК фрагмент включва четири стъпки: рязане на ДНК с рестрикционни ендонуклеази. ДНК лигиране с вектора. трансфекция и последваща проверка.

Изолиране на вложки

Първоначално, трябва да изберете област от ДНК за клониране. Често препарат ДНК се приготвя за клониране чрез полимеразна верижна реакция. както и намаляване на ДНК с рестрикционни ензими. ДНК лечение ултразвук. фракциониране на ДНК чрез агарозна електрофореза. Изолиране на вложки могат да бъдат направени пушка клониране технология, комплементарна ДНК. изкуствен химичен синтез.

трансформация

След лигиране на плазмид се трансформира бактерии да се изгради. Бактериите продължават да растат на селективна среда за подбор на колонии, съдържащи инсерции. Отделните колонии са избрани и изследвани за присъствието на вмъквания.

трансфекция

След лигиране на реакционната смес с вграден в желаната ориентация вектор се поставя в клетката. В зависимост от типа на клетката използва химически чувствителност клетки, електропорация или генна пушка. За химическата сенсибилизация не изисква специално оборудване. Електропорация се използва в случай на нужда от високо трансфекция ефективност. пистолет ген се използва в случай на растителни клетки и тъкани, тъй като стената на растителна клетка предотвратява чужда ДНК да проникне в цитоплазмата и ядрото.

Получава култура на трансфектирани клетки. Тъй като по-горе описаните процедури често имат ниска ефективност, за откриване на метода на клетки, съдържащи желания вложката в правилна ориентация и отделяне на такива клетки от не-паста. Съвременни вектори за клониране включват избираеми маркери, които позволяват на клетките да растат само с правилната вложка растат по селективна среда. Клониращи вектори съдържат също маркери често причиняващи оцветяване на колониите, например когато се отглежда в среда, съдържаща Х-гал. За точно потвърждение на успешно клониране трябва да се провери с помощта на полимеразно-верижна реакция. RFLP или ДНК секвениране.

генна терапия

ДНК клониране

DNA Cloning - предварително определен процес на екстракция на ДНК последователността и производството на много копия от него ин витро. Клониране на ДНК често се използва за амплифициране на фрагменти, съдържащи гени. както и всяка друга posledovatelnosti- например, промотори. некодираща последователност. химически синтезирани олигонуклеотиди и произволни региони на ДНК.

Източници: humbio.ru, dommedika.com, www.biotechnolog.ru, dic.academic.ru, ru.rfwiki.org