1. естествена среда, култура (рядко се използва).
Физически хранителни среди са получени въз основа на солеви разтвори Ханк и Earl, към които се добавят серум, околоплодна течност, ембрионален екстракт. Тези телесни течности са източник на протеини храна, витамини и други вещества, насърчаващи растежа и пролиферацията на клетките. Например, една среда за култивиране на клетки HeLa: Човешки серум - 50% пилешки ембрионални екстракт - 2% разтвор на Hank - 48%.
2. Ензимните хидролизати на протеини.
С добавянето на ензимни хидролизати: лакталбумин, казеин, кръвни протеини в говеда.
3. синтетични хранителни среди, които са различни сложен състав:
Среда 199 (Parker) съдържа 20 аминокиселини, витамини, 17 пурини и пиримидини, глюкоза, девет минерални соли и други вещества. Тази среда се получава в Hanks физиологичен разтвор, стерилизирана чрез филтруване през бактериален филтър.
Dulbecco съдържа 13 аминокиселини, 4 от катион, анионът на 3, 6, витамини, холин, инозитол и въглехидрати.
1.2.2. Видове клетъчни култури
За получаване на клетъчни култури с помощта на различни животински тъкани, човешки и птици като ембрионално и зрели. Освен използването на нормални и злокачествени тъкани възражда получени от тумори.
Източникът на ембрионална тъкан често пилешки ембриони и човешки ембриони, мишки, свине, зайци и други. Ембрионалните и туморни тъкани имат по-добро оцеляване и растеж на по-активни от възрастни тъкани. бъбречната тъкан се използва най-често от зрели тъкани (маймуни, морски свинчета, хамстери, и т.н.), човешка околоплодна мембрана.
Тъканите взети асептично, промива се в солев разтвор на Hanks, и след това се подлагат на смилане. При употреба вирусология само нараства тъканна култура, които са разпределени в:
1. Култура на определени части от тъкан.
2. еднослойни клетъчна култура:
а) първична култура на клетки;
б) трансплантиран (стабилна) клетъчна култура;
в) култивиране на диплоидни клетки.
3. Култура клетки на тяхната суспензия.
В практически вирусология често използват еднослойни култури. клетки, които растат и се размножават като прикачени към твърд субстрат (стъкло, пластмаса), образуващи слой от една клетъчна дебелина (монослой). обработка монослой метод клетъчна култура на базата на първоначалния ензим лечение на тъканта (обикновено трипсин) нарушаване на междуклетъчната комуникация; тъканта се диспергира и се образува суспензия от единични клетки. Когато култивирани клетки са прикрепени към стъкления съд и растат в непрекъснат монослой, което позволява удобно да се работи върху клетките от тях заразяване с вируси и визуално се наблюдава получената промяна в динамиката.
а) първична култура от клетки могат да се размножават само в първото поколение
Методика за получаване на първични култури от пилешки ембрионални фибробласти
1. Яйцата се инкубират 7-11 дни ovoskopiruyut. Убедени в жизнеспособността на ембриона, да се обособят границите на въздушната възглавница.
2. обвивка на големия край на яйцето се изтрива с алкохол, йод, алкохол отново, и след това отсека на нивото на въздушната възглавница.
3. Премахване на ембриона и се поставя в стерилен чаша, отстраняване на главата. ембриони измиване тялото 3-5 мл разтвор на Ханк, който след това се аспирира.
4. тяло ембриони внимателно се натрошават получени задна части (около 1 mm3 в размер) отпипетират във флакона.
5. Извършва прането 2-3 пъти нарязан тъкан с кръв. Всеки път се излива в тръбата с тъканта на 2-3 мл, се получава тъкан се утаи и след това течността се аспирира.
6. Към промиват тъкани се прибавят 3 мл от 0.25% разтвор на трипсин и старателно се разбърква съдържанието на тръбата посредством "пипетиране" (nasasyvaniya множествена пипетиране и разпенващ течност) или енергично разклащане. Под действието на трипсин тъканни клетки се отделят и се образува суспензия и по този начин за установяване на по-големи частици на дъното на тъкан супернатантни тръби трябва да остане мътна.
7. Горният слой е мътна течност, съдържаща суспензия от клетки, изолирани, се прехвърля в центрофужна епруветка, към който 2,5 мл предварително излива хранителна среда лакталбуминов хидролизат. Центрофугирането се извършва при 1000 об / мин в продължение на 10-15 минути.
8. Супернатантата се отстранява, клетъчната пелета се прибавя към 3.2 мл лакталбуминов хидролизат и се смесват добре, клетките се суспендират отново. За да се отделят клетъчните конгломерати които могат да попаднат в кашата, се препоръчва, последвано от филтруване през мрежа от неръждаема стомана или марля.
9. произведени брои клетки в камерата Горяев под ниско микроскоп увеличение. Определя се концентрацията на клетките в суспензия, неговата лакталбуминов хидролизат се разрежда до 400 000 клетки в 1 мл.
10. Суспензията се излива във флакона от 1 мл, запечатани с гумени запушалки и се поставят в инкубатор при 370с в наклонено положение под ъгъл 50.
След 3-4 дни от старта на култивирането, за търсене на епруветките при ниско увеличение на микроскопа, можете да видите, продълговати процеса клетки - фибробласти, които растат на стената на тръбата за образуване на монослой.
б) непрекъснато клетъчна култура (клетъчна линия)
Трансплантиран клетъчни култури имат редица предимства в сравнение с основната. Работата с тях отнема по-малко време, те се отличават с голям диапазон на чувствителност към много вируси. Въпреки това, не обезсмъртен подходящ за производство на вирусни ваксини, тъй като има опасения за евентуалното им злокачествено заболяване.
Непрекъснато клетъчна култура без субкултура в прясна среда, доста бързо се изражда. Следователно, първоначалната клетъчна култура се отглеждат в хранителна среда, матраци със седмично рекултивиране на културата в нови съдове. Когато работите с тръба култури също препоръчват ги пресадени в 7-8 дни или веднъж на всеки 3-4 дни, за да се замени с хранителна среда с прясна, а след това на клетъчните култури остават жизнеспособни в продължение на 2-3 седмици.
За култивирането на непрекъснати клетъчни култури, използвани среда 199 (често допълнена с 10% телешки серум), среда на Eagle, допълнена с 20% серум, 0.5% лакталбуминов хидролизат, съдържащ 5% телешки серум.
а) Култури от диплоидни клетки
Те се наричат poluperevivaemymi култури, тъй като имат способността да INI субкултура за дълго време - може да издържи до 40-50 пасажи, проведени по време на 8-10 месеца. След това културата се изроди и умират клетки. Те се наричат диплоиден, защото те твърдо поддържа диплоиден кариотип, присъщи на оригиналните нормални телесни клетки - диплоидна предци линия.
Култури от диплоидни клетки, получени от различни човешки фетални тъкани от първични култури. Така, например, използва известен щам DKLCH (човешки диплоидни белодробни клетки) WJT-38 щамове, JMR-90, MRC-5 от човешки ембрионални белодробната тъкан.
Диплоидният култура се използва за изолиране и култивиране на вируси. Те са податливи на много щамове на вируси, онкогенно безопасни и подходящи за култивиране в промишлен мащаб и произвеждат големи количества от вирусни ваксини.
Фиг. 2. Клетъчни Култури
Техните суспензия културални клетки
Окачени култура - култура, в която отделните клетки или техни конгломерати постоянно се суспендира в течна среда.
Клетките в суспензионна култура може да се получи, ако се извършва култивиране при непрекъснато енергично разбъркване от въртенето на средата в тръбите барабан с магнитна бъркалка и др Напоследък се използват специални устройства - .. хемостати в който е осигурен автоматична актуализация на средата. Окачени клетки имат по-висока активност на растежа, се натрупва в голямо количество в редовна подмяна на средата остане жизнеспособна в продължение на дълго време.
1.3. Отглеждане на вируси в кокоши ембриони
Много вируси, които заразяват хората и животните може в по-голяма или по-малка степен, за да се размножават в пилешки ембрион. Наличието на плътна обвивка предпазва ембриона от влизането на микроорганизми от външната среда.
Метод за култивиране на вируси в ембрионни кокоши яйца се използват в лабораторната диагностика на вирусни инфекции и за производство на вирусни ваксини и диагностични агенти. Но този метод има някои недостатъци: 1) не могат да се наблюдават в динамиката на патологични изменения, които настъпват в ембриона след инфекция с вируса; 2) при откриването на ембриони инфекциозен вирус често не се откриват видими промени и е необходимо да се установи наличието на вируса в тъканите в ембрион течности се използват други методи вирусологични (например, хемаглутинацията реакция); 3) метод за култивиране в ембрионни кокоши яйца подходящи не за всички вируси. Въпреки недостатъците на метода е сравнително прост, удобен и евтин и широко използван в вирусологично изследване. Най-високата стойност има при работа с ортомиксовирусна, херпес вируси, поксвирусии.
1.3.1. Структурата на пилешки ембрион
Пиле ембриона, покрити с варовикови черупки - плащам, на които се опира на вътрешната skorlupnaya обвивка. Тъпият край на яйцето е раздвоена и се състои от въздушното пространство. Съгласно skorlupnoy обвивка е хориоалантоинова мембрана в тъп край на яйцето минава по протежение на вътрешната страна на обвивката skorlupnoy, затваряне на въздушното пространство, тази обвивка богата на кръвоносни съдове и служи ембриони тяло дишане. От вътрешната страна тя се вписва алантоисно, което е разпределението на органи и предпазва ембриона от изсушаване и нараняване. Алантоисно обгражда ембриона, която е в амниотичната кухина, която се запълва с околоплодна течност. След ембриони вителиновата кабел, свързан към жълтъчната торбичка - основен източник на хранителни вещества.
определени температурни условия, необходими за успешното отглеждане на вируси в тялото на развиващите пилешки ембриони (360-380), влажност (50-70%), както и подходяща вентилация. Infect пилешки ембриони на определена възраст, инкубират се от 6 до 13 дни в зависимост от вида на вируса и инфекция метод. Необходимо е да се подготви: палмови яйца мехурчета с алкохол и йод, флаконът със стерилна парафин, покриване на очила, чанти стерилна марля и вълна, обвита в хартия стерилен контейнер, стерилни спринцовки, форцепс, дисекция на иглата. Инструменти, поставени в стъклена чаша с алкохол, където те работят по целия, преди всяка допълнителна манипулация стерилизирани чрез изгарянето им в факел пламък. Ръцете преди работа старателно измити, се препоръчва да носят маска на марля.
За да работите жизнеспособни ембриони са избрани, prosvechivaya инкубира яйцата просветляване. Жизнеспособна ембрион е подвижен, кръвоносните съдове, пълни с кръв обвивка. Избрани яйца добре дезинфекцирани в тъп край (или от страна на яйце в) черупката изтрива с алкохол, йод смазани многократно калцинира и се третира с алкохол.
1.3.2. Заразени пилешки ембриони хориоалантоинова мембрана
За инфекция с помощта на пилешки ембриони 10-12 дневна възраст. Основните етапи на инфекцията:
1. яйце се поставя на позиция в изправено положение, така че въздушната възглавница се намира по-горе, стерилизация се извършва обвивка на големия край на яйцето.
2. над центъра на торбичката за въздух, изработен от черупки на пробиване с игла дисекционен.
3. инжектира в дупката и челюстта на ножицата намали прозорец в черупката на около 1.5 cm в диаметър.
4. игла дупка напрежение внимателно skorlupnoy вътрешен слой обвивка и кръгообразно в малка област (0,5-1 cm2).
5. Produce заразени хориоалантоинова мембрани чрез прилагане на 0,1-0,2 мл вирус-съдържащ материал с пипета на Пастьор или спринцовка.
6. прозореца в черупката покрита със специален стреч фолио или стерилен покривно и да се придържате с разтопен парафин.
Заразени ембрионите се поставят в термостат във вертикална позиция и се инкубират в продължение на 2-3 дни, след което произвеждат отваряне на следните правила:
1. яйцето се поставя върху стойката, така че въздушното пространство е на горния етаж, отваряйки пространство стерилизация.
2. стерилни ножици отрязани обвивката на граничния въздушното пространство.
3. С пинсета, извадете skorlupnuyu черупка на границата. Голи хориоалантоинова мембрана са нарязани по краищата на черупката. След дупката се излива цялото съдържание яйца в чашата или тава.
4. Останалата в мембрана черупка хориоалантоинова се отстранява внимателно с помощта на пинсети и се поставя в стерилен чаша с физиологичен разтвор. Ето това се изправи и изучава промените чрез поставяне на чашата на тъмен фон.
Поради големия обем на материала се поставя на няколко страници:
1 2 3
Свързани статии