оцветяване micropreparations

Повечето мастила, използвани в микробиологията, принадлежат към производни на бензол и се екстрахират от каменовъглен катран.

Багрила, използвани в микробиологията, соли са два вида: 1) кисели багрила - са тези, в които йон, който придава цвят (хромофор) е анион (например еозин); 2) основни оцветители - тези, чиято роля хромофор катион (пример е метиленово синьо).

Багрила от първия вид са киселинни защото хромофор е киселина, образуването на соли придаващи цвят, комуникира с основа (NaOH).

Багрила от втория тип се наричат основен защото хромофор, като основа, образуването на соли с киселина се свързва (HCl) /

Обикновено, кисели багрила свързват по-интензивно с цитоплазмени (основни) компоненти на клетката, а главната - ядрена (киселинен).

Действието на някои багрила не зависи от образуването на соли или други химични съединения с оцветяващи материали. Те просто покриване на повърхността, адсорбиран, утаява или разтворен в материала.

В процеса на боядисване играе роля както физични и химични фактори

Има прости и сложни методи за оцветяване micropreparations.

Прости методи за оцветяване

За прост метод на оцветяване micropreparations най-често използваните основни анилинови бои. Много широко използван метил синьо, основния fuchsine, кристално виолетово, тионин.

Прост метод боядисване може да се използва за оцветяване на мъртви микробни клетки, определени в пързалки, както и за жизненоважни за оцветяване на микроорганизми.

Цвят в живота трябва да се разглежда само като един, в който цветни организми остават живи за дълго време, както и способността да се възпроизвеждат. Има няколко метода за жизненоважен оцветяване, включително начинът Nakanischi.

При този метод, чисто стъкло се излива в наситен воден разтвор на метиленово синьо, суши се и се избърсва със суха кърпа, докато покритието на боя не ще светлина - син оттенък. На покривни подготвят намазка от тестваните микроби, тогава не се суши до края на лекарството се прилага върху предметно стъкло с багрилото. С помощта на микроскоп можете да видите как микробите остават живи, без да губи своята активна мобилност (ако има), постепенно боядисани в синьо.

Този метод е ценна с това, че при неговото прилагане няма опасност от изкуствени продукти за лечение в идентифицирането на някои функционални характеристики на микробните клетки.

Сред прости техники за оцветяване, има както положителни, така и отрицателни начини за оцветяване.

С прости положителни методи за оцветяване включват метода на оцветяване Lnefflera и отрицателно - метод оцветяване Buri.

За боядисване чрез метод Leffler на (Loffler) може да се прилага разтвор на метиленово синьо (боядисване Leffler), която разкрива много детайли и форми на микроорганизми структура. Leffler багрило е смес от двата разтвора А и Б.

Разтвор А: метил синьо - 0,3g етилов алкохол - 30,0ml.

Разтвор Б: КОН (0.01%) - 100 ml.

Сместа се добре запазена в колба с шлифована запушалка.

За получаване на по-чисти препарати, боя може да се излее върху филтърна хартия, покрита с намазка или използва предварително импрегнирани багрило филтърна хартия и се суши. В този случай, фиксирана намазка насложени ленти krasilelem сухо импрегнирани филтърна хартия, и след това се прилага върху хартията пипетира няколко дестилирана вода и шпатула или форцепс се притиска към стъклен филтър хартия. Багрилото се промива от хартията и намазка цветове. След оцветяване време, филтърната хартия се отстранява, лекарството се промива внимателно с течаща вода, суши се и mikroskopiruyut.

При правилно оцветени и добре измити препарат зрително поле е светъл и чист, и ще бъдат боядисани само микробните клетки.

В допълнение към положителните начини за оцветяване в някои случаи се прилага отрицателен (контраст) методи. В този случай, микроорганизмите в което багрилото не проникват, се появяват като светли частици върху равномерно цветен фон.

Много често за негативно оцветяване micropreparations използване на течен черно мастило ( "отрицателен метод» Burri).

Като фон Бури подготовка излее течност мастило. Спирала не е вярно багрило, така че тялото на микробите остават неоцветени; в резултат се оказва сякаш отрицателен имиджа си.

При този метод, мастило се разрежда с вода в съотношение 1: 9, 1: 1 или 1: 2.

Тъй като самата мастило може да съдържа бактерии, се стерилизира чрез добавяне на няколко капки от формалин или автоклавира 30 мин при 110 градуса. Преди употреба, приготвени мастилото (и разрежда стерилна) трябва за два - три седмици се поддържа в състояние на покой, за да се утаи суспендираните частици в него. При приготвяне на препарати, използвани Тушев горния супернатант.

Спад на черно мастило се прилага на предметно стъкло и се смесват напълно с капка бактериалната суспензия. Сместа се намазва с тънък слой върху повърхността на ръба слайд на стъклото на покритие. Когато тъмен слой се суши, фиксиран лекарствен и се изследва под микроскоп. Микробните клетки се разглеждат като безцветни клетки и тъмен фон на лекарството.

течност спирала на негативно оцветяване може да се използва също така водни разтвори kongorot (3% 0, Нигрозин (10%) и някои други багрило за оцветяване отрицателни багрила може да се извърши по два начина: или разтвор багрило се прилага към сух фиксирана намазка, след промиване с вода и сушене mikroskopirovat ;. спад на суспензията от бактерии се смесват с багрило и покрита с покривно mikroskopiruyut. и в действителност, и в двата случая на микробни клетки са безцветни.

Сложни техники за оцветяване

Един прост метод за положителни или отрицателни метод микроорганизми оцветяване много подходящи за различни цели (изучаването на формата и разположението на клетките, оразмеряване, за откриване на капсули от микробни клетки в намазки -. Отпечатъци на органите на заразения организъм, и т.н.).

Въпреки това, един прост метод на оцветяване не могат да се диференцират микроорганизми (включително бактерии) подобни по форма и размер, но принадлежащи към различни видове, прост метод за боядисване не може да открие зрели спори и кисти, разлята от клетките в среда, прост метод за боядисване не позволява за откриване на клетки с комплексна структура и т.н. обвивка.

Поради тази причина голяма стойност е сложните техники за рисуване, за да получите представа не само за формата, размера, разположението на клетките спрямо друга, което позволява диференциация на бактерии и определят структурните детайли на микробните клетки.

Сред най-изтънчените методи цвят стойност представлява метод за боядисване на датски учени разработват грам позволява микроорганизми да се диференцират в две големи групи, наречени "Грам-положителни" и "грам-отрицателни", което е от голямо значение при определяне на микроорганизми.

Този метод се нарича диференциал цвят боядисване. В основата на диференциация лежи грам микроби клетъчна стена и цитоплазмената мембрана собственост.

В основата на клетъчната стена на грам-положителни и грам-отрицателни микроорганизми е пептидогликан. Грам-положителните бактерии пептидогликан има няколко слоя, в грам-отрицателни - той odnosloen.

Грам-положителни бактерии, има гъста и многопластови пептидогликан, комплексът, образуван когато се оцветяват с кристал виолет и последваща обработка на разтвор на йод не се промива с алкохол, и клетките не са обезцветени и запазват пурпурен цвят. Докато грам-отрицателни бактерии, имащи тънък слой пептидогликан, обезцветява с алкохол. С допълнителен цвят магента или sapraninom грам-отрицателни клетки са оцветени в sirenevato - червено.

Микроорганизми, които запазват цвета, наречени "грам-положителни" и определени "D +" и обезцвети - "Грам-отрицателни" и са означени с "Т".

Индикатори диференцират грам-положителни и грам-отрицателни микроорганизми:

Грам-положителни микроорганизми не са чувствителни към действието на стомашния сок, не се налага сложна структура. Устойчив на основи, чувствителни към лизозим, пеницилин, йод. Изразено слабо имуногенни свойства, оптимален растеж на относително високо рН. На живо състояние по-пропускливи за багрилата са чувствителни към електролити. Може да бъде киселина устойчив и може да спорулира. Има пластове пептидогликан и тикоикова киселини могат да съдържат. Клетъчната стена е порьозна, с ниско съдържание на протеини, пептиди, аминокиселини състав монотонни. Липидите няколко, много гликопротеини (99%).

Грам-отрицателни микроорганизми, в много случаи, разтворени от стомашния сок, разтворени в 1% разтвор на КОН са чувствителни към киселини. Нечувствителен към лизозим, пеницилин, йод. Е изразена имуногенните свойства. Оптимален растеж при ниско рН. Жилищната състояние е лошо пропусклива за анилинови бои. Устойчив на слаби електролити, не образуват спори. Основата е един слой на пептидогликан клетъчната стена, тейхоева киселина отсъства. Клетъчната стена на ниска порьозност, има сложна структура, която съдържа всички аминокиселини. Lipid много (до 22%), гликопротеини малки (5-9%).

Решения за метод оцветяване грам:
1. Разтвор А - Crystal Violet - 2,0g, етилов алкохол 95% - 20,0ml.
2. Разтвор В - амониев оксалат - 0,8g Дестилирана вода - 80.0 мл.
Разтвор А се разрежда с дестилирана вода (1: 5) и след това се смесва с равен обем от разтвор Б.
3. разтвор Lugol - йод кристален - 1d, калиев йодид - 2.5 грама Дестилирана вода - 80,0ml. Сместа се оставя в продължение на 24 часа, за да се разтвори йод.
4. Разтвор за допълнително оцветяване - sapranin или фуксин (2.5% разтвор в 95% етанол) - 25 мл. Дестилирана вода - 75 мл.

Методи за оцветяване метод Грам:
1. фиксираната намазка съдържащ микробни клетки, боядисване тинтява виолетово (2 минути).
2. източване тинтява виолетово, и след това се прилага за получаване на разтвор на Lugol (2 минути).
3. Внимателно разтвор се излива Lugol и се промива състав от 95% етилов алкохол (30 секунди Клетки с цветни многослойни пептидогликан остават тинтява виолетово, един слой на пептидогликан -. Обезцветени).
4. Получаване внимателно се изплаква с вода.
5. натривки петно или sapranina разтвор фуксин (1 - 2 минути).
6. Получаване внимателно промиване с вода, суши се на въздух при стайна температура или в поток от топъл въздух над пламъка на горелката, или чрез внимателно Мокра филтърна хартия.
7. изследва с микроскоп лекарството.

До комплекс разлика - диагностични методи включват боядисване и оцветяване и по метода на Ziehl - Nielsen (Ziehl - Naelsen), което позволява да се разграничат киселина резистентни микроорганизми от другите, не е нужно това свойство.

Подготовка и боядисване mikopreparata Ziehl - Nielsen, проведено както следва:
1. Изготвяне на конвенционален метод за фиксиран материал намазка тест (нето или пациент храчки култура).
2. На фиксираната намазка постави филтърна хартия и се излива в разтвор на карболовата фуксин. предметното стъкло се закрепва към форцепс Cornet и лекарства в 4-та се нагрява над пламъка на горелката (като изпаряване на разтвора на течно багрило се прибавя).
3. След 4 минути (в края на топло) филтърна хартия внимателно отстранени с препарат намазка и 30 секунди, за да се прилагат 5-10% разтвор на сярна или солна киселина, получен в 95% етилов алкохол.
4. След 30 секунди, получаването внимателно се промива със студена течаща вода и допълнително dokrashivayut метиленово синьо.

Механизмът на киселина оцветяване микроорганизми от Ziehl - Neelsen да се обясни както следва: а нагряване препарат восък, част от обвивката е омекотена, и по този начин багрилото прониква в бактериалната клетка. Охлаждане, восък запазва багрило, следователно алкохол, багрилото се елуира с киселина само от клетки, които не са киселина резистентност. С допълнително оцветяване с метиленово синьо петно с променен цвят клетки и по този син фон ще бъде ясно видима AFB, боядисани в червено.

Решения за боядисване на Ziehl - Nielsen:
1. Разтвор А - основен фуксин - 0,3g, etildovy алкохол 95% - 10,0ml.
2. Разтвор В - фенол (стопени кристали) - 5,0g Дестилирана вода - 95 мл.
3. Разтвор на метил Leffler синьо или зелено блестящ.
Разтворите А и В се смесват (карболин магента). Сместа е добре запазена.

На практика, при изучаването микроскопични инсулти - отпечатъци от органи, кръв намазки, в изследването на спирохети, протозои, хламидия, тъканни култури са широко използвани друг комплекс метод оцветяване - петно Романовски - Giemsa.

Методи за оцветяване Романовски - Giemsa:
1. Получаването се суши, фиксирани в течна фиксатор (метанол 3 - 5 минути).
2. лекарството се изсушава и се поставя в бехерова чаша с разтвор на работа багрило (20 излагане на 25 минути при 37 градуса. Концентрация на разтвора на багрило и експозицията трябва да се титрува). Боядисва се отново намазка диференцирани етилов алкохол (50-60 градуса), внимателно се промива с вода, суши се и mikroskopiruyut.

Решения на бои за оцветяване Романовски - Гимза:
1. Вариант А. Разтвор - 3,8g сухо мастило, състоящ се от смес от еозин и метиленово синьо, разтворени в 250 мл чист метилов алкохол или етил. Разтворът се оставя за няколко дни, често разклащане в продължение на най-доброто разтваряне боя. След това 250 мл чист глицерин и се оставят в продължение на 3 - 5 дни, често разклащане. Полученият разтвор - боя Романовски - Гимза.
Преди употреба, боята, се дозира в разреждания 1: 1, 1: 2, 1: 3, и т.н. получен с използване на дестилирана вода в продължение на 20 - 25 минути.
2. Вариант Б: Прилагане на цвят лазурно - еозин.
а) 1 г суха боя Романовски - Гимза (лазур и метиленово синьо) се разтваря в един литър дестилирана вода.
б) 1 г еозин се разтваря в един литър дестилирана вода.

Тези две решения се съхраняват отделно на тъмно място в стъклени съдове с чаша запушалка.

За оцветяване препарати получени ех Tempore работен разтвор:
10 мл дестилирана вода
4 мл разтвор еозин
8 мл от разтвора на багрило Романовски

Предпоставка за получаване на добро качество оцветители е вода (рН на водата трябва да бъде неутрален).