Цел: да се изследва методи за съхраняване на клетъчните култури, предимствата на криоконсервация на растителни клетки, основните етапи, както и трудностите, срещани във връзка с особеностите на растителни клетки.
1. Бавно клетъчен растеж
2. Основните етапи на криоконсервация
2.1 Получаване на културата
2.2 Замразяване и съхранение
2.3 Размразяване и премахване на криопротектор
2.4 рекултивиране клетки и оценена след криоконсервация
1 Към момента на създаването на нови сортове растения и редовна смяна, което се дължи преди всичко със загубата на различни симптоми, поява на нови гъза lyatsy вредители и болести, изменението на климата, SMO-ти и редица други причини. Средната продължителност на живота на сортове пшеница и други зърнени култури обикновено е 5-10 години. Да се разработи нов боклук-ING и подобряване на стари изисква различни генетични майка др. С цел запазване на генетичния фонд на редки и застрашени видове, на цена-нето на местата за размножаване и щамове - производители на икономически важни-ционни материали разработени методи за създаване на колекции и ин витро генни банки.
Основният източник на гени са семена. За да създадете нови клетъчни линии. Синтез-ал-ценни продукти, необходимостта от съхранение на събиране на клетки, който е стандарти-продуциращи клетки, които са определени характерните-тикове. За да се изследва физиологични и биохимични процеси в култивирани клетки става необходимо запазва дълго neniya първоначалните стандартни клетъчни линии. По този начин, за да отговори на предизвикателствата, необходими за съхранение на методи за клетъчни култури. Има два подхода към решаването на този проблем: (. От гръцките kgyos - "студен", "лед") инхибиране на клетъчния растеж и съхранение в замразено състояние, т.е. крио-съхранение. Предизвикателството е да се промени кинетиката на растеж на културата и Уве-lichit време между трансфери. Това би позволило на трансплантация задънена обиколките на всеки 3-4 месеца, една година или дори по-рядко. В момента забавяне повлияни от фактори, които ограничават растежа, постигнат само за културите, пуснали и регенерирани растения.
Най-ефективният начин за забавяне на растежа е да се намали ТЕМ-perature култивирането в комбинация с намалена светлина. температура Ти-борен се определя от вида на устойчивостта на растенията към студ. По този начин, за депозиране картофени колекции използва температура от 10 ° С и 1 ° С ябълка препоръчва за култури обикновено растат при 20 - 25 ° С, за да се използва 4-10 С
На растежа на растенията може да се забави добавянето на хранителна CFE де osmotikov на - манитол и сорбитол, захароза концентрация увеличава или въвеждане в културална среда на вещества, които инхибират растежа на. През последните kaches-ТВЕ се използва хидразид на малеинова киселина, 2,2 - metilgidrazid hlorholinhlorida янтарна киселина, абсцисова кисел-та. В много редки случаи, за бавен растеж с помощта на изчерпване на кислорода - хипоксия. Създаване на условия хипоксия се използва смес от 90% азот и 10% кислород. Понякога се намали концентрацията на кислород и едновременно намаляване на атмосферното налягане. За да се предотврати изчерпването на хранителните запаси и обем дехидратация на среда за дозиране да се забави расте задънена кръг увеличение. Ако използвате течна среда, то долива от време на време, тъй като тя е активно се изпарява.
Криоконсервация 2 - дълбоко замразяване и съхранение на много ниски температури, например при температурата на течния азот (-196 ° С). Тази температура осигурява стабилно поддържане на генетичните характеристики на обекти в практически всяка дължина. Този метод позволява да съхранявате най-различен материал - от изолирани протопласти за ембриони и семена. В момента Zamo дълбоко замразени от клетки, тъкани и органи е широко разпространено в медицината и животновъдство. Ситуацията е различна с растително-мате риал. Основните трудности са свързани със спецификата на растителната клетка и чрез процес на дълбоко замразяване. Растителните клетки с големи размери, голям вакуола и много вода, повече повредени чрез замразяване и последващо размразяване. -Set клетки увредени поради образуването на лед, както в клетки и снаряд-жа. Ice обикновено се формира за първи път през външния разтвор около клетките. цитоплазма точка на замръзване на минус 1 ° С, но клетките не са дозиращи-zshimi до около 10-15 ° С, тъй като до този плазмалемата допълнително предпазва от проникване на ледени кристали, растящи в външния разтвор. Растежът на ледените кристали в клетъчната мембрана го унищожава.
Ако температурата се намалява бавно, времето за клетка, за да загуби част от свободната вода, която излиза от него и замръзва на poverhnos накъде бавно растящи кристали във външната решение. Това не е придружено от бързо замразяване и дехидратация води до Novena-произхожда ледени кристали в цитоплазмата. Бавно замръзване MO-Jette елиминира напълно кристализацията на вода в клетката, но неизбежно има значителна дехидратация и ни компресия protoplaz. Обезводняване случва, защото клетките на външен концентрацията на разтвора се дължи на образуването на лед в него. Прекалено плазмените-Lys и ги причинени осмотичен стрес (особено в следващия deplazmolize) води до клетъчна смърт.
По този начин, причина за клетъчна смърт по време на замразяване е образуването на вътреклетъчен лед и механични повреди на мембраната, и осмотичен стрес, причинен от силни дехидратация клетки. Следователно, всички техники, използвани в криоконсервиране на правило в конкретния баланс на двата вредни фактор серпентини. Оцеляването на растителни клетки, зависи от редица условия: ген имат възможност за и техните морфологични и физиологични характеристики и способността да холо-dovomu закаляване, състава и количеството на естествени или изкуствено добавени криопротектори, степента на пропускливост на тези вещества и скорост на намаляване на температурата на водата и условия размразяване.
Работата по Krios съхранение клетъчна култура се състои от следните етапи (Фигура 18): - получаване на клетъчна култура,
- съхранение в течен азот,
- рекултивиране и възстановяване на растенията.
Фигура 18. Етапи криоконсервация на клетъчни култури
2.1 Нека разгледаме основните етапи на криоконсервация на клетките. Експериментално възможност за съхранение при ниски температури култивирани клетки, изолирани меристеми Cum-ващи издънки, ембриони, полен. Въпреки това, за такава криоконсервация пъти Lich взаимосвързани обекти, разбира се, изисква различни подходи и условия, считано от началния етап на експлоатация. Най-доброто от всички техники за криоконсервация разработен за окачване култури. Meristemoidnye малки клетки са по-устойчиви на замразяване от големи вакуолен клетки. Същото се отнася и до суспензии на фино диспергиран --- с насипни агрегати на клетки, в сравнение с голям MI гъсти маси клетки. Клетките тропически видове растения могат да бъдат по-малко стабилни от растителните клетки на умерения пояс. За по-сложни организационни структури, като меристеми произхожда-ши, embryoids се изисква да се оптимизират условията на всеки етап. От особено значение е специалната култура обучение, целта на сътрудничеството Тора е да обогати меристематични клетъчен тип. Дългосрочна култивиране в osmotike, синхронизация на клетъчното делене, намаляване на условия трансплантация допринесе за намаляване-стенд-Ing размери и увеличаване на тяхното оцеляване. На отделните култура-положителен ефект върху клетъчната жизнеспособност има пред
предварително задънена tivirovanie някои аминокиселини чрез повишаване на ендогенните нива на захар в клетките. За суспензионни култури важно MO-среда за обучение е концентрация.
2.2Krioprotektory - вещество, което намалява по точка merzaniya свърже вътреклетъчния вода и защитават клетките от механични и осмотичен стрес. Те включват монета-сулфоксид (DMSO), глицерол, пролин и захароза, която е растителни природни криозащитни. Криозащитни себе си може да предизвика осмотичен стрес, така че те избрани оптималните концентрации Най и комбинации.
DMSO има уникална способност на проникване, тя е специален, но е важно за големи плътни организирани структури, като например мет-Рист. Като етап препарат е основно предварително предварително култивирани в среда, допълнена с 5% DMSO. Това гарантира, е осигурено създаването на ефективни концентрации на криопротектори около върха на размер от около 0,3-0,5 мм.
Заедно с избора на криопротектори, и то е за данните от лепени ток, това е много важно да се намери оптималната програма замръзване. Различни бавно chayut постепенно замразяване, бързо и sverhbys-три. При бавно постепенно температурата на замръзване в интер-вала от 0 до около - 40 ° се намалява в размер на 0.5-1 минути. Когато бързо съоръжение замразяване в ампула с криопротектор веднага се потапя в течен азот. В ултрабързи замразяване на обект-правителствена чрез директно се въвежда в течен азот. Прашец може да бъде замразен в суха форма, в специален запечатана пластмасова ампула от тях потапяне в течен азот. Данните, получени Cryobank на IGF в Москва показват, че БО Лея успешен резултат дава програмираната замръзване. Това изисква специален дизайн с работната камера, охлаждащата-мината програмирана скорост на въвеждане на течен азот изпарения.
2.3 Размразяване и възстановяване на растежа на културите - отговорност и често критични стъпки на процеса. С твърде бавно размразяване клетките в тях има повтаряща формация лед, правейки yuschee увреждащо действие. Бързо размразяване предотвратява това. Размразяване про-изпаднал потапяне флакон в топла баня (40 ° С) за замразено или накапване Предмети на топла вода или културална среда. Въпреки това, в изключителни случаи, бавно размразяване е по-подходящо.
След размразяването криопротектори се отстранява, което обикновено се прави на студено. По-голямата част от физически промени се срещат в клетките по време на замразяване и размразяване, но само че размразени клетки са силни, но са склонни към по-нататъшно увреждане и следователно изискват tscha-Ing "кърменето." Тя започва с директно ток разсаждане лепилото по намаляване на околната среда, без изплакване клетки с опазване на криопротектори. Често криопротектори се отстранява чрез специален мустак-loviyami измиване.
2.4 Състояние на култури otse нишка е много трудно, когато материалът е за криоконсервация. Оценяването се извършва след размразяване и необходимостта от култури ЕО употреба. TEN-вие сте най-подходящ за оценка на бързото реколта
жизнеспособност. Тестове за предпочитане се извършва веднага след размразяване, и на следващия ден. Тестове, проведени периодично по време на повторен растеж за мониторинг на увеличаването на съдържанието zhiz неспособни клетки или жива тъкан.
За пробите, които са видими под микроскоп при преминаваща светлина, т.е.. Е, клетъчни суспензии, протопласти, калус и организирана малки правителствени структури, използвани fluorestseindiatsetatom оцветяване fenosafraninom. За мазоли и дебели организира големи бани структури, използвани тетразолиева сол.
Оцеляване е количествена оценка на растежа. Изследване на растежа на култивирани клетки при използване на някой от стандартните методи за измерване на растежа, включително мокро и сухо наддаване на тегло, обем на установени клетки оп имат възможност за клетъчна плътност, директно микроскопско наблюдение. Стан-нение цитологични техники позволяват да се оцени степента на вредни отлагания и процеса за възстановяване, срещащи се в тъканите. Дори и по-точни данни се получава в изследването на ултраструктурата в Ном на електронен микроскоп.
Като се има предвид хетерогенността на клетъчните култури, като ги подготвя за замразяване на-НИП не може да се изключи напълно възможността за появата на селективни предимства за някои подгрупи от населението, по-специално в ниската степен на преживяемост след размразяване. Затова има нужда от генетични, физиологични и биохимични проверка.
В етап рекултивиране понякога използват известни техники засилване на растежа на клетките, за да се избегне избор на възможните студено толерантни мутантни клетки. Установено е, че за съхранение в течен азот няма ефект върху оцеляването и подновяване на клетъчни култури. идентичен на оригинален клетъчната култура и са полезни за биотехнологични приложения регенерирани след съхранение в течен азот.
Така cryobank клетки, меристеми, прашец осигурява съхраняването на генофонд не само култивирани ин витро-продуциращи щамове, но и редки и застрашени видове, което е особено важно за вегетативно размножени растения.
1. Методи за генетичен опазване ин витро.
2. Какви са предимствата на криоконсервация на клетките?
3. Какво е криопротектори?
4. Получаване на клетките за криоконсервация.
5. Как е замразяване и размразяване на клетките?
Позоваването
5. Калинин FL Sarnatsky VV Polishchuk VV методи на култивиране
тъкани и клетки в растителна физиология и биохимия. -Kiev Naukova Dumka,
1980 година.
6.Valihanova GJ Rakhimbaev IR Karzhasova AV Bishimbaeva NK
Методическото ръководство за практическо обучение в тъканна култура
растения. -Alma Ата KazGU 1983.
7.Kataeva PV Butenko RG Клонираните микроразмножаване rasteniy.-
М. Наука, 1983.
8.Gleba YY Sytin да KM Cell инженерни растения. -Kiev:
Naukova Dumka 1984 година.
9.Butenko RG Културата на растителни клетки и биотехнологията. -M: Наука,
1,986.
10. клетъчно инженерство / Butenko RG Гусев MB. Kirkin AF
Biortehnologiya, Т. 3. -M. Гимназия по 1987.
11. Plant Biotechnology: клетъчна култура. - М;
Agropromizdat 1989 година.
Mamyrbekova Aigul Kumekbaevna, Abubakirova Азхар Abdugapparovna
Свързани статии