Методите за клониране на ДНК
Геномни библиотеки, клониране на ДНК ин виво
След ДНК се омрежен ин витро, е необходимо да се възпроизведе.
Има два подхода за клониране на ДНК. Първият подход включва използването на бактериални или дрождени клетки се размножават въведени в него чужда ДНК. Вторият метод е ДНК амплификация ин витро.
Клониране на ДНК ин виво
Използване на микроорганизмите може да създаде два вида ДНК библиотеки: и геномен клон (сДНК).
Генната банка. Ако генома на организма да се намали, поставете в плазмид или вирусен вектор и се въвежда в клетката, може да се съхранява в тази форма. При рязане плазмид или фаг ДНК вероятността от цели и непроменени части от генома е доста висока.
Този метод за получаване на геномна библиотека, наречена "пушка секвениране", тъй като в този случай генът съдържа отделни фрагменти.
Принципи за създаване на плазмид и вирусни вектори като цяло, така че можем да ги примера на плазмид разгледа. Трябва да се отбележи, че тъй като на вирусната ДНК е по-добре да се използват фагови ДНК, тъй като те имат по-голям капацитет и ще направи възможно да се вмъкне по-големите парчета на генома.
Пречиства кръгова ДНК молекула се обработва с рестрикционен ензим за получаване на линейна ДНК. Клетъчната ДНК се третира със същия рестрикционен ензим, плазмид се добавя, добавя лигаза. Така получен рекомбинантен плазмид ДНК, която се въвежда в бактериални или дрождени клетки. Плазмид репликира и образуват множество копия. Много плазмиди носят ген за резистентност към антибиотици, и ако рекомбинантния плазмид е ген, клетките бяха лесно идентифицирани чрез отглеждане в среда с антибиотик.
Всяка колония е потомство или клонинг на една клетка. Плазмидите, съдържащи единична колония клон геномна ДНК и плазмиди агрегат може да се нарече геномна ДНК библиотека. Недостатък на този метод е, че ДНК фрагменти се произвеждат в големи количества. Рязане случай на геномна ДНК се определя, така че само част от фрагментите съдържат пълни гени. Някои фрагменти могат да съдържат само част от ген или интронни последователности.
кДНК библиотека. Осъществяване сДНК синтез започва с RNA шаблон чрез обратна транскриптаза комплементарна ДНК верига. След създаване на основни условия унищожи РНК нишка на нуклеотиди, след това се използва ДНК полимераза синтезира комплементарна ДНК верига. Това представлява ДНК фрагмент с тъпи краища. Тази ДНК се вмъква в плазмида и се въвежда в бактериална клетка. Когато амплификацията плазмид генерира клон комплементарна ДНК копие (сДНК).
Предимства за клониране на ДНК клон геномна ДНК, която кодира протеин, нуклеотидната последователност на гена не прекъсва.
Гените на еукариоти съдържат интрони, които трябва да бъдат отстранени от transkriptnoy РНК преди превръщането му в матрица, последвано от съединяване (сплайсинг). Бактериални клетки не могат да извършват такава модификация на РНК, образуван от транскрипцията на гена на еукариотна клетка. Ето защо, ако преследва препарат протеин чрез експресия на клонирания ген, е добре да се използва сДНК библиотека получава въз основа на РНК.
Други глави в този раздел:
Свързани статии