Методи за запазване на генофонд
Методи за забавяне методи криоконсервация
При получаване на клетъчни линии с полезни признаци, че има проблем за запазване на тези функции. Растенията могат да съхраняват генетичната информация в семената, но източникът не е напълно надеждна, тъй като с течение на времето в резултат на мутации кълняемост падания. Освен това, някои растения се размножават вегетативно. Това се дължи на необходимостта да се запази част от ин витро материал. От друга страна, в някои случаи е възможно да се получат нови клетъчни линии, които синтезират по-голям брой вторични метаболити, че е по-продуктивна, което също трябва да се поддържа.
За изучаване на физиологичните и биохимични процеси в тъканите, в стандарта се изисква оригиналната култура, отколкото се дължи на необходимостта от запазване на материал за определен период от време, когато има серийни експерименти. Всичко това прави проблема с опазването на генетичния фонд от голямо значение.
Можете, разбира се, пасира и непрекъснато клетъчна култура. Въпреки това, съществува риск от самоклонално вариант, натрупване на мутации замърсявания (замърсяване с чужд генетичен материал). Той също изисква определени финансови и трудови разходи (необходимостта от чести преки разходи, свързани с околната среда, и т.н.). Целта на изследователите е да се увеличи интервалът между трансфери. Има различни подходи за опазване на културите:
- сушене (спрей и лиофилизация) - за микробни клетки.
Криоконсервация - замразяване при много ниски температури. Обикновено, той се провежда в течен азот при -196 ° С
опазване успех ниска температура зависи от няколко фактора:
- външен вид и тип клетки,
- концентрацията им в суспензията,
- Състав на средата за съхранение,
- вида и концентрацията на криопротектор,
- охлаждане и затопляне,
- начин за възстановяване на клетките след размразяване.
Значителна роля в успешното замразяване на клетки играе им morphophysiological състояние: клетки в стационарна фаза на растеж, са по-устойчиви на вредния ефект на запазване на ниска температура, отколкото клетките в експоненциалната фаза на растеж. Клетките бяха избрани за замразяване в средата на експоненциалната фаза на растеж крива.
Еднакво важно е плътността на суспензията се замразяват. Оптимални резултати за клетки за възстановяване са получени чрез замразяване плътността на клетъчната суспензия от 1 х 10 5 - 5 х 10 6 клетки в 1 мл.
предварително култивиране при специфични условия често се изисква за растителни клетки. В сряда, добавят различни вещества, като например:- 2-6% манитол или сорбитол да се намали размера на вакуоли;
- аминокиселини, особено пролин, който служи да свързва водата в клетката (концентрацията на 1 мол или 11,5%), аспарагин # 947; аминомаслена киселина;
- диметил сулфоксид (DMSO), който се прибавя към средата за predkultivirovaniya концентрация от 2.5 до 10% в продължение на 48 часа, за да се увеличи пропускливостта на цитоплазмената мембрана;
- освен това изкуствено втвърдяване на студено, при ниска температура култура, симулиращи естествен процес падане на подготовка за зимата латентност период (приложимо само за умерени климат на растения). Клетъчните култури се поддържат няколко дни при температура от 8-10 ° С, и след това при 2-5 ° С за 1 - 6 седмици.
Замразяване растителни клетки от животни се различава основно етапи присъствие пред-култура.
Криозащитни - вещества, които намаляват вредното действие на физични и химични фактори за криоконсервация. Те включват захароза, декстран, етилен гликол, поливинил пиролидон, диметилсулфоксид (DMSO), глицерол. За да се определи токсичността на криозащитни клетки се инкубират при стайна температура в неговите различни концентрации в продължение на 30 - 50 минути, и след това определяне на тяхната жизнеспособност. Освен оцени своите защитни свойства, от тест-културите на замразяване-размразяване. Най-често се използва като криозащитни глицерол и DMSO. Преди добавянето на криопротектор Клетъчната суспензия се концентрира чрез центрофугиране, супернатантата се изхвърля. Криозащитни допринасят за културата за един час преди замразяване, което води до промени в мембранната пропускливост, промяна на точката на замръзване и размразяване.
програма охлаждане може да бъде различен, но се характеризират с бавна скорост на охлаждане. Когато замразяване настъпва образуването на лед и извън клетките. Естеството на тези промени зависи от криопротектанти пробата за изпитване и обработка, но главно на скоростта на охлаждане. На бавно охлаждане извънклетъчен образуването на лед се появява, което води до клетъчна дехидратация преди достигане на точката на замръзване цитоплазмата. С бързо охлаждане се замразява в клетки, дехидратира бавно, което води до образуването на ледени кристали в клетката. В този случай, на увредените клетки. Обикновено охлаждането се извършва в два етапа (Фигура 26):
Фиг. 26. замразяване на клетки: а) бързо, б) бавно, постепенно
Етап 1: от 20 до -28 ° С при скорост от 1 ° на минута (0.5 градуса за замразяване растителни клетки скорост на минута до -35 ° С), се поддържа при тази температура в продължение на 15 минути.
Втори етап: потапяне в течен азот (моментно охлаждане до - 196 ° С).
Замразяване се извършва в специални апарати. В отсъствието им - алкохол баня (0.5 - 1 литър алкохол се излива в колба метални термос се потапя в нея в продължение на 15 минути ампули и се добавя, с разбъркване течен азот или сух лед, температурата се довежда до трябва да бъде -32 ° С (температурата не по-висока от -28 и не под -32 ° с). След това ампулата се прехвърля в течен азот.
При размразяване ампули форцепс прехвърлени на водна баня при 37 - 40 ° С, обемът на ампула от 1 мл размразена в продължение на 0.5 - 1 минута.
След размразяване, клетките бяха промити или в растежна среда (животни) или в поддържащата среда. Растителните клетки могат да бъдат изпиране 3-10% разтвор на захароза.
След това, клетките се изследват за жизнеспособност при използване жизненоважни багрила, оцветители мъртви клетки. Крайният критерий е ясно завръщане към растеж на стандартния среда, използвана за култура.
Трансплантиран животински клетъчни култури след размразяване са повишена чувствителност към вируси, които са показани за първите два пасажа. Освен това, чувствителността се връща към оригинала.
Бавен растеж може да се постигне по следните методи:
1. съхранение под слой на минерално масло (за гъбични и бактериални култури).
2. Промяната на състава на газ и атмосферното налягане в съда за култивиране.
3. Промяна на режима светлина.
4. Охлаждане температура край на активен растеж.
5. Използването на хормонални и осмотични инхибитори. От хормонални инхибитори най-често се използва hlorholinhlorida (до растителни клетки) на осмотичното - манитол в концентрация от 3-6%.
6. Заместването на CaCl2 Са (NO3) 2 в хранителна среда.
Картофено като метод, който позволява да се запази генофонд, се препоръчва образуване на възли в епруветки.
Други глави в този раздел:
Свързани статии